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AtMYB44 modulates crosstalk between jasmonate- and salicylate-mediated plant defense responses

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Authors
심재성
Advisor
최양도
Major
농업생명과학대학 농생명공학부
Issue Date
2013-08
Publisher
서울대학교 대학원
Keywords
AtMYB44R2R3 MYB 전사인자자스몬산 신호 전달 체계살리실산 신호 전달 체계WRKY70애기장대
Description
학위논문 (박사)-- 서울대학교 대학원 : 농생명공학부 응용생명화학 전공, 2013. 8. 최양도.
Abstract
식물은 다양한 병원체의 공격으로부터 자신을 보호하기 위하여 유기적인 방어 기작을 가지고 있으며, 이 방어기작은 식물 호르몬에 의해서 조절된다. 이 과정은 식물 호르몬인 살리실산 (salicylic acid)와 자스몬산 (jasmonic acid)에 의해 주도적으로 조절된다. 살리실산은 바이오트로픽 병원균에 대한 방어기작을 담당하는 주요 식물 호르몬으로서 NPR1 및 PR 유전자의 발현을 조절하여 병원균을 사멸하는 역할을 한다. 자스몬산은 네크로트로픽 병원균 및 곤충에 대한 방어기작을 담당하며 COI1, VSP, PDF 유전자의 발현을 조절하여 병원균의 공격을 방어한다. 자스몬산과 살리실산은 길항작용을 하며 효과적인 방어기작을 유도하는 것으로 알려져 있다. AtMYB44는 식물의 R2R3 MYB 전사인자 그룹에 속하는 유전자로 자스몬산과 살리실산 등에 의해 발현이 유도된다. 이 유전자의 기능 분석을 위하여 AtMYB44의 과발현 식물체 및 삽입돌연변이 식물체 (atmyb44)를 이용하였다. AtMYB44 유전자를 과발현시킨 식물의 경우 자스몬산 신호전달을 받는 하위 유전자들의 발현이 억제되었고 외부에서 메틸자스몬산 (methyl jasmonate)을 처리하였을 때도 대조군에 비해 하위 유전자가 낮은 수준으로 발현되는 것을 확인하였다. AtMYB44 과발현 식물체는 자스몬산이 매개하는 뿌리 성장 저해, 안토사이아닌 생합성 및 뿌리털 발달에 있어서 대조군에 비해 적은 영향을 받는 것을 확인하였다. 또한 살리실산에 반응하는 하위 유전자의 경우 AtMYB44 과발현 식물체에서 그 발현이 증가하는 것으로 나타났다. atmyb44 삽입돌연변이체의 경우 과발현 식물체와는 반대로 자스몬산에 반응하는 하위 유전자의 발현이 증가하고 살리실산에 반응하는 하위 유전자의 발현이 감소하는 것으로 나타났다. 이와 같은 하위 유전자의 발현 양상과 사물기생 병원균인 Alternaria brassicicola와 활물기생 병원균인 Pseudomonas syringae pv. tomato DC3000을 이용한 실험을 통해 AtMYB44가 자스몬산과 살리실산에 의한 식물체의 방어메카니즘을 길항적으로 조절함을 확인하였다.
AtMYB44 과발현 식물체의 특성은 살리실산을 분해하는 효소가 과발현된 식물체인 NahG에 의해 회복된다. 하지만 살리실산 신호전달의 중요 조절인자인 NPR1은 AtMYB44의 발현 및 기능에 있어서 직접 작용하지 않음을 확인하였다. 따라서 AtMYB44의 기능에 있어서 살리실산이 중요한 역할을 하며, 이 유전자는 NPR1이 아닌 다른 조절인자에 의해 기능함을 확인하였다. AtMYB44 과발현 식물체에서 발현이 증가하는 유전자 중에 WRKY70은 자스몬산과 살리실산의 상호작용에 있어서 중추적인 역할을 하는 유전자이다. WRKY70은 AtMYB44 과발현 식물체에서 발현량이 증가하며 AtMYB44를 유도발현한 경우에도 발현이 유도되고, atmyb44 돌연변이식물체에서 발현이 감소되는 것으로 보아 AtMYB44의 하위에 존재함을 증명하였다. WRKY70은 살리실산 반응을 매개하는 중요 조절인자로서 NPR1에 의해 부분적으로 조절되는 특징을 가지고 있다. 이에 기반하여 제작한 이중돌연변이체 (atmyb44 npr1-1)를 이용한 실험에서 WRKY70의 발현이 AtMYB44와 NPR1에 의해서 각각 독립적으로 조절됨을 확인하였다. AtMYB44 전사인자를 통한 자스몬산과 살리실산의 신호전달 조절원리를 규명하기 위하여 이 전사인자의 결합서열 (5’-CNGTTA-3’)을 systematic evolution of ligands by exponential enrichment (SELEX) 실험을 통해 찾아내었다. 그리고 프로모터 분석을 통해 AtMYB44의 조절을 받는 WRKY70 유전자의 프로모터 지역에 AtMYB44의 결합서열이 존재함을 확인하였다. AtMYB44와 WRKY70의 관계를 확인하기 위하여 yeast one hybrid (Y1H), electrophoretic mobility shift assay (EMSA), chromatin immunoprecipitation (ChIP)를 수행하였고 이를 통해 AtMYB44 전사인자가 식물체 내에서 WRKY70 유전자의 프로모터 지역에 결합함을 증명하였다. 또한 Nicotiana benthamia를 이용한 co-infiltration assay 및 효모를 이용한 trans-activation activity 실험을 수행하여 AtMYB44가 WRKY70 유전자의 프로모터에 결합하여 발현을 증가시킴을 증명하였다. 이러한 실험 결과로부터 AtMYB44 전사인자가 WRKY70 유전자의 프로모터에 결합하여 WRKY70 유전자의 발현을 직접 조절하고, 이를 통해 자스몬산과 살리실산에 의한 식물의 방어 반응을 조절한다는 것을 밝혀내었다.
Transcription factors, which can interact with cis-element and regulates series of responsive genes, are critical components in a complex signal network. AtMYB44, an R2R3 MYB transcription factor, is associated with various defense signal cascades. AtMYB44 is induced by jasmonic acid (JA) through CORONATINE INSENSITIVE 1 (COI1) and by salicylic acid (SA) through the NONEXPRESSOR OF PR1 (NPR1) independent pathway. AtMYB44 overexpression plants showed lower defense responses against a necrotrophic pathogen Alternaria brassicicola (A. brassicicola). It coincides with the suppression of JA-mediated defense responsive genes by AtMYB44 overexpression. AtMYB44 overexpression resulted in elevated expression of WRKY70 and PR genes, leading to enhanced resistance to the biotrophic pathogen Pseudomonas syringae pv tomato DC3000. The knockout mutant atmyb44 showed opposite effects. To test whether the effects of AtMYB44 overexpression are mediated by SA, AtMYB44 overexpression plants were crossed with the SA depleting plant NahG. Overexpression phenotype of AtMYB44 such as growth retardation, up-regulation of PR genes and down-regulation of PDF1.2 were reversed by SA depletion. It means that SA is required for function of AtMYB44. ß-estradiol-induced expression of AtMYB44 resulted in hierarchical activation of WRKY70 and PR1. Induction of WRKY70 by SA is reduced in the atmyb44 and npr1-1, and is totally abolished in atmyb44 npr1-1 double mutant. These data showed that WRKY70 is also regulated by AtMYB44 through the NPR1 independent pathway. Effect of AtMYB44 overexpression such as activation of PR1 and suppression of PDF1.2 are abolished in the wrky70 knockout mutant. It suggests that activation of PR genes and suppression of PDF1.2 by AtMYB44 are mediated by WRKY70. AtMYB44 directly binds to at least two WRKY70 promoter regions containing the cis-element (5’-CNGTTA-3’), and the C-terminal region of AtMYB44 has transcriptional activation activity. It indicates that AtMYB44 act a transcriptional activator of WRKY70 through direct binding to a cis-element in the WRKY70 promoter. These results demonstrate that AtMYB44 regulates antagonistic interaction between JA and SA by activating SA-mediated defense responses and suppressing JA-mediated defense responses through direct control of WRKY70 expression.
Language
English
URI
http://hdl.handle.net/10371/119440
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Appears in Collections:
College of Agriculture and Life Sciences (농업생명과학대학)Dept. of Agricultural Biotechnology (농생명공학부)Theses (Ph.D. / Sc.D._농생명공학부)
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