약물 유발 심장독성 평가 및 항당뇨 효능 평가를 위한 HCS 기법 개발

Abstract

근래에는 약물에 의한 세포 내 변화를 동시에 검출하고자 하는 노력의 일환으로 High-content screening (HCS) 기기를 구축하고 있다. HCS 기기를 이용하면 세포에 표지된 여러 가지 서로 다른 emission 파장을 가지고 있는 형광 probe 각각을 선택적으로 관찰할 수 있다. 이러한 기술은 스크리닝을 위한 약물검색 세포기반 에세이에 적용할 경우, 약물에 의해서 일어날 수 있는 많은 on/off 타겟 효과 및 세포 독성을 한 번의 세포 기반 에세이를 통해서 가능한 최대로 비용적 효율성을 갖추어 검증할 수 있다. 본 연구에서는 acousto-optic tunable filter (AOTF) 기반 HCS 장비를 제작하였다. 본 HCS 장비는 현미경, AOTF 및 CCD 카메라로 구성되어있는데, 본 장비의 가장 큰 특징은 세포에서 발광된 여러 파장의 빛을 AOTF를 통과시킴으로써 원하는 특정파장의 빛만을 선택적으로 얻을 수 있다는 것이다. 즉, 빛이 AOTF를 통과하여 특정 파장의 빛은 diffraction되고 나머지 빛은 undiffraction 되어서 분리되게 되는데, diffraction된 특정 파장의 형광만을 CCD 카메라로 감지함으로써 원하는 세포 영상을 얻을 수 있다. 본 장비의 성능을 테스트하기 위하여 서로 다른 형광 emission 파장을 가지고 있는 형광프로브를 세포에 staining시킨 후, 각각을 분리해서 감지할 수 있는지를 관찰하였다. 그 결과, 각각 524, 579, 그리고 624 nm에서 최대 발광 파장을 가지고 있는 형광프로브 물질들이 효과적으로 분리•검출되는 것을 확인할 수 있었다. 그에 따라 후속 실험으로, 본 장비를 이용하여 약물 유발 심장독성 평가에 관한 연구를 시행하였고, 약물의 염증기전 억제를 통한 인슐린 저항성 개선 효과에 대한 연구도 실시하였다. 심장박동은 심장의 활동전위에 의해서 조절이 되는데, 이러한 활동전위는 심장근육의 세포막에 존재하는 수많은 이온 채널들의 작용들에 의해서 발생한다. 특히, 세포막에 존재하는 Na+ channel과 K+ channel을 통한 이온들의 유출 및 유입에 의해서 주기적으로 탈분극/재분극이 발생하게 된다. 그러나 이러한 이온채널의 활성에 변화에 이상이 생길 경우 심장에 이상증세가 발생하여 QT 간격 연장 및 단축 (Long/short QT interval) 현상이 발생하게 되고, 더 나아가 서맥(bradycardia), Torsades de pointes(TdP), 그리고 돌연사의 위험을 증가시키게 된다. 이러한 심장이상은 약물에 의해서 유발될 수 있다. 따라서 본 연구에서 실시한 약물 유발 심장독성 연구는 camptothecin과 deguelin 유도체인 SH-03에 의해 유발되는 H9c2(2-1)세포 독성을 세포 내 나트륨 농도/칼륨 채널의 투과성 변화, 세포자살(apoptosis) 그리고 세포괴사(necrosis)를 AOTF기반 HCS 장비를 이용하여 동시에 측정함으로써 실행하였다. 그 결과 camptothecin과 SH-03에서는 특정 농도(camptothecin 600 nM

SH-03 50μM)에서 세포 내 나트륨 농도, 칼륨 채널의 투과성 변화, 그리고 세포사멸이 관찰되었다. 본 연구 결과, 특정 농도 이상에서는 세포 독성이 유발되어 세포막 투과성에 이상이 생겨서 이온 농도가 변하는 것을 확인할 수 있었다. 약물의 염증기전 억제를 통한 인슐린 저항성 개선 효과에 대한 연구는 HepG2 세포에 TNFα를 처리하여 인슐린 저항성을 유도시키고, 염증기전과 insulin signaling에 관여하는 여러 종류의 protein를 동시에 관찰함으로써 실행하였다. 인슐린 저항성이란 인슐린 기능이 떨어져서 세포가 포도당을 연소시키지 못하는 것으로 제 2형 당뇨병의 특징 중에 하나다. 인슐린 저항성이 높을 경우에 인체가 인슐린을 혈중에 과다분비시켜서 당뇨병뿐만 아니라 고혈압, 고지혈증 등 다양한 질병을 초래할 수 있다. 특히 간에서 인슐린 저항성이 나타날 경우에는 glucose metabolism에 이상이 발생하여, 혈액 내 증가된 인슐린을 인식하지 못하고 hepatocytes 내 glycogen을 분해하여 포도당을 분비시킨다. 최근 여러 연구들에 의해서 inflammatory pathway와 insulin signaling이 밀접한 관련이 있다는 것이 증명이 되었다. 따라서 약물이 inflammatory pathway 내의 특정 kinase를 타겟으로 할 경우에도 인슐린 저항성을 개선시킬 수 있을 것이라 생각된다. 그에 따라, 본 연구에서는 염증기전과 insulin signaling에 관여하는 여러 종류의 protein을 선택하는 데 있어서 inflammatory pathway에서는 3 종의 protein (IKKβ, JNK1, 그리고 p38α)을 선택하였고, insulin signaling 내에서는 4 종의 protein (IRS1ser307, IRStyr, GSK3β, 그리고 FOXO1)을 선택하였다. HepG2 세포에 3 종의 specific inhibitor (p38 inhibitor, JNK inhibitor, 그리고 IKK β inhibitor), 2 종의 anti-inflammatory drug (asprin과 indomethacin), 또는 2 종의 한약재 주요성분 (amygdalin-행인

cinnamic acid-계피)를 처리한 뒤, 세포 내에 존재하는 각 protein을 검출할 수 있도록 각각의 protein은 phospho-primary antibody/형광표지-secondary antibody를 처리하여 형광을 라벨링시켰다. p-GSK3β의 최대 emission 파장은 525 nm이고, p-p38, p-JNK1, 그리고 p-IKKβ의 최대 emission 파장은 565 nm 이다. p-IRS1ser307, p-IRStyr, 그리고 p-FOXO1의 최대 emission 파장은 각각 605, 705, 그리고 655 nm 였다. 한 번에 5 개의 형광을 검출하였는데, 그 group은 다음과 같다: p38/GSK3β/IRS1ser307/IRStyr/ FOXO1, JNK1/GSK3β/IRS1ser307/IRStyr/FOXO1, 또는 IKKβ/GSK3β /IRS1ser307/IRStyr/FOXO1. 형광 검출은 본 연구실에서 개발한 AOTF 기반 HCS 장비를 이용하였다. 먼저 염증기전 내 protein kinase 중에서 인슐린 저항성에 영향을 미치는 것으로 알려진 p38, JNK, 그리고 IKKβ를 각각 inhibition 시킨 후 HCS를 실시한 결과, 각 타겟의 인산화가 억제되었고, 그 하위 기전도 억제되어 insulin sensitivity가 향상되는 것으로 나타났다. 즉, insulin sensitivity 개선은 p38, JNK, 그리고 IKKβ-dependent pathway를 통해서 일어날 수 있음을 알 수 있었다. 현재 상용화되고 있는 aspirin과 indomethacin을 이용해서 insulin sensitivity 향상을 알아본 결과 aspirin과 indomethacin 모두 JNK/IKKβ-dependent pathway를 통해 insulin sensitivity가 향상되는 것을 알 수 있었다. Amygdalin과 cinnamic acid의 경우에는 모두 JNK-dependent pathway를 통해 insulin sensitivity가 향상되는 것을 알 수 있었다.