Structural insights into the dimerization domain of human Filamin A and allosteric conformational change of CRP from escherichia col

Abstract

Filamin은 actin filaments에 교차 결합함으로 actin 세포골격을 조절하는 역할을 수행한다. Actin 세포골격의 재구성은 세포의 모양유지, 세포 분화, 세포 이동과 식세포작용과 같은 다양한 세포의 기능에 중요한 역할을 한다. 또한 Filamin은 β-integrins와 같은 transmembrane receptors와 cytosolic signaling proteins 를 고정시키는 역할을 하여 다양한 cellular process들에 관여한다. 인간에게 있는 세 종류의 isoform중 filamin A가 가장 흔하고 널리 발현되는 Filamin A는 각 subunit 당 280kDa의 분자량을 갖는 V-형의 dimeric 단백질이고, 한 개의 Actin binding domain과, 24개의 repeating homologous rod domain들과 두 개의 hinge regions으로 구성되어 있다. 각 rod domain은 샌드위치 모양의 β-sheets로 구성된 immunoglobulin-like folding을 갖고 있다. 그 중 24번 rod domain을 Crystallography를 이용하여 3차 구조를 규명하고, 이를 바탕으로 dimerization 양상을 관찰하였다. Strands C와 D에서 쌍방의 수소결합과 Hydrophobic 결합을 통하여 강하게 dimerization을 이루고 있으며, filamin 전체를 dimerization시켜 유연한 V-형의 homodier로 만들고, 이를 통해 actin networks를 안정화 시킨다. 또한 Ig-like 단백질들과 다른 filamin isoform의 dimerization domain과 구조를 비교하여 공통점과 차이점을 분석하였다. E. coli유래의 Adenosine 3, 5-Cyclic monophosphate (cAMP) receptor protein (CRP)은 transcription regulation, DNA-binding motif, 단백질의 allosteric activation에 대한 예시로 오래 전부터 교과서에 실린 널리 알려진 단백질이다. 특정 DNA sites와 결합하고 RNA polymerase와 상호작용을 통해 200여 개 이상의 유전자의 전사를 조절하는데 중요한 역할을 한다. CRP는 각 subunit이 209개의 아미노산으로 구성된, 24kDa의 분자량을 갖는 homodier이다. 각 subunit은 DNA와 결합하는 C-terminal domain (CDD)과 cyclic nucleotide와 결합하는 N-terminal domain (NND), 두 domain을 연결하는 짧고 flexible한 hinge region을 갖는다. 특히 C-terminal의 F-helix는 이웃한 E-helix와 전형적인 helix-turn-helix를 구성하여 특정 DNA를 인식하는 역할을 한다. 하지만 이 DNA 인식작용은 cAMP의 부재 시에는 일어나지 않으며, cAMP 결합에 의한 활성화에 의해 allosteric conformation 변화에 의해서 일어난다. 또한 최근 단백질 dynamics에 대한 연구를 통해 CRP의 dynamic allosterism에 대해서도 밝혀지고 있다. 1980년대 이래로 CRP의 3차 구조는 10여개 이상 밝혀져 있지만, 이들 대부분이 CRP- cAMP, CRP-cAMP-DNA, CRP-cAMP-DNA-RNAP등의 활성화 상태의 구조들이다. 근래에 inactive 상태의 CRP 구조가 X-ray crystallography와 NMR을 통해서 밝혀졌지만, 이것들은 너무 낮은 resolution을 갖고 있거나, 변종들의 구조인데다가, 결정 구조와 NMR 구조가 서로 다르기에 CRP의 conformational allosterism에 대해서는 명확히 결론 지을 수 없는 상황이다. cGMP는 purine 부분을 갖는 cAMP 유사체이고, CRP와의 결합 상수도 비슷하지만, CRP가 특정 DNA sequences와의 결합을 활성화 시키지 못한다. 또한 cAMP는 최대 4개의 분자가 CRP dimer와 결합하는데, cGMP는 최대 2개의 분자가 결합한다. 많은 cAMP와 cGMP의 CRP 결합에 관한 변종 실험들에서도 cGMP는CRP의 allostery의 control probe로 사용되었다. 하지만 아직까지 cGMP-CRP complex의 구조는 규명되지 않고 있다. 본 연구에서는, 2.2Å이라는 높은 resolution의 wild-type의 apo-CRP의 구조를 규명하는데 성공하여, 이전의 inactive 구조에서 보다 향상된 원자 수준의 분석이 가능하게 되었다. 게다가 2.2Å의 높은 resolution의 cGMP-CRP 구조도 최초로 규명하였다. 이를 통해 cAMP의 유사체이지만 비 유효 분자인 cGMP의 작용 기전에 대한 연구를 수행하였으며, 이를 통하여 CRP의 conformational allosterism에 대한 연구를 진행하였다. CRP의 allosteric conformational change는 도메인의 local fold에는 변화가 없지만 NTD와 CTD를 연결하는 hinge의 재구성을 통하여 방향성의 변화에 의하여 일어나며, 이는 L134를 스위치로 하는 hydrophobic cluster의 재구성에 의해 강한 힘을 갖고 있으며, hinge region의 helical 특성의 변화도 분석된다. 또한 cGMP와의 complex에서는 cyclic nucleotide들이 2단계로 결합하는 단계적 결합에 대한 증거를 확인하였고, cGMP와의 결합은 CRP를 단순히 활성화시키지 못하는 것뿐만 아니라, conformational change가 cAMP와는 반대적으로 일어나고, 내부에 파묻혀있는 DNA 인식 부위인 F-helix를 더 강하게 붙잡고 있는 것으로 보아 CRP의 비활성 상태를 더욱 안정화 시키는 것을 확인하였다. 이러한 분석 결과를 토대로 CRP의 allosteric conformational change에 대한 model을 제시하였다.

Filamins play important roles in regulating the dynamics of the actin cytoskeleton which plays a central role in many cell functions and plays as integrators of cell mechanics and signalling by interacting with transmembrane receptors and cytosolic signaling proteins. In humans, three filamin isoforms have been identified: filamin A, filamin B and filamin C. Of these, filamin A is the most abundant and widely expressed. FLNa missense mutations cause familial cardiac valvular dystrophy and putative gain-of-function mutations result in a spectrum of congenital malformations generally characterized by skeletal dysplasias. Human vertebrate filamins are homodimers of two 280kDa subunits, and each subunit contains an N-terminal actin binding domain consisted of two calponin homology domains followed by 24 tandem repeat domains and two hinge regions. 24th repeat domain was dimerization domain, which results in a V-shaped flexible parallel homodimer. Here, we report the structure of FLNa domain 24 (FLNa24), compare the structure with FLNc24, and discuss how dimerization is formed in FLNa24. CRP has long served as a typical textbook example describing transcription regulation, DNA-binding motif, and allosteric activation of a protein. CRP plays a critical role in regulating the transcription of more than 200 genes by binding to specific DNA sites and interacting with RNA polymerase. The inactive CRP structure would provide an insight into the structural basis of CRP. In the present work, we succeeded in obtaining higher-resolution (2.2 Å) crystal structure of the wild-type apo-CRP, which would be the most proper template for precise inspection of inactive conformation and establishes here the mode of conformational transition in atomic detail. In addition, we report the first crystal structure of another inactive form, the cGMP-CRP complex, at also 2.2 Å resolution, which not only support our insight into the conformational allosterism, but also address how CRP discriminates the false ligand cGMP from its authentic effector cAMP. And also the conformational allostery change of CRP by cyclic mucleotide and structural difference between apo-CRP, cAMP-CRP and cGMP-CRP was discussed.