The therapeutic effects of protease-defective S478A of tissue plasminogen activator and Pyruvate in rat brain ischemia model

Abstract

수세기 동안 허혈로 인해 야기되는 뇌졸중 치료 약물에 대해 많은 연구가 진행 되었으나 아직까지 표준 치료제를 찾지 못하고 있는 실정이다. 본 연구는 뇌졸중 치료 가능성 약물을 찾아 랫드를 이용한 뇌허혈 모델에 투여 후 치료 효과를 증명하는 데에 목적을 두고 실행하였다. 첫번째 뇌졸중 치료 가능 약물로 재조합 조직 플라스미노겐 활성제(tPA)와 프로테아제 결손 조직플라스미노겐 활성인자(S478-tPA)를 선택하여 효소 비의존성으로 뇌실질 보호 효과를 확인하였다. 뇌조직 세포 배양 조건에서는 tPA와 S478A-tPA는 아연에 의한 세포독성에 대해서는 뇌세포 보호 효과가 있었다. 랫드 영구적인 뇌허혈 모델에 중뇌동맥폐쇄 15분 후 플라스민이 적은 뇌실로 tPA와 S478A-tPA를 투여시 대조군에 비해 65.70% 뇌경색이 감소 되었다. 뇌허혈 일주일 이후에도 대조군에 비해 뇌경색 감소 효과와 운동결손이 개선되는 뇌졸중 치료 효과는 지속되었다. 두번째로 피루브산을 선택하여 뇌졸중 치료효과를 관찰하였다. 피루브산을 랫드의 일시적 (1시간) 또는 영구적 뇌허혈 모델에 복강 또는 정맥주사로 62.5-250 mg/kg 농도로 투여시 투여방법과 농도에 상관없이 뇌경색이 대조군에 비해 50%이상 줄어드는 것을 확인 할 수 있었다. 영구적인 뇌허혈 모델에서는 투여 14일 이후에도 뇌경색과 운동결손을 감소시키는 뇌졸중 치료효과를 보였다. 흥미롭게도 높은 농도의 피루브산투여는 뇌경색을 감소시키지는 않았다. 이는 수소자기공명분광분석을 통한 젖산 농도 측정시 치료농도에 비해 높은 농도를 보여주는 것으로 확인할 수 있었다. S478A-tPA는 뇌출혈과 흥분세포독성을 증가시키는데 관여하는 단백질 효소분해활성 기능은 없으면서 뇌조직실질에 신경보호효과와 뇌경색치료에 효과적이라고 할 수 있다. 피루브산나트륨는 인체 내생의 해당작용 대사산물로서 알려진 부작용이 거의 없는 무해한 당이며 저가의 약물이다. 본 실험의 결과로 이 두가지 약물은 인체 부작용이 없는 뇌졸중 치료 후보 약물로 사용가능성을 제시할 수 있다.

Despite intensive investigation over the last couple of decades, there is no standard parenchymal neuroprotective treatment available for ischemic stroke. So, we find to possible agent for ischemic stroke treatment. The purpose of this study was to examine the therapeutic effects of candidate agents in rat brain ischemia model. At the first, we examined parenchymal effects of tPA and its non-protease mutant S478A-tPA in permanent focal cerebral ischemia in rats. Before doing in vivo experiments, effects of tPA and S478A-tPA on zinc or NMDA toxicity were first studied in cortical cultures. Like tPA, which has protease-independent cytoprotective effects, the non-protease mutant S478A-tPA blocked zinc toxicity in cortical cell cultures, but did not affect calcium-mediated NMDA toxicity. Then, effects of tPA and S478A-tPA on infarcts induced by permanent occlusion of middle cerebral artery (MCA) were investigated. tPA and S478A-tPA were administered into the cerebral ventricle 15 min or 1 h after MCA occlusion. Both tPA and its non-protease mutant S478A-tPA, when given 15 min after ischemia, substantially reduced infarcts and ameliorated motor deficits in the MCA occlusion model of focal cerebral ischemia. However, when administered 1 h after MCA occlusion, neither showed protective effects. The protective effects of tPA or S478A-tPA remained unchanged at 7 days after MCA occlusion. At the second, we examined the therapeutic effects of pyruvate in focal cerebral ischemia in rats. Pyruvate markedly reduces neuronal death following transient global ischemia. In the present study, we investigated the possible neuroprotective effect of pyruvate in focal ischemia. Pyruvate (62.5–250 mg/kg) treatment, regardless of whether given intraperitoneally (ip) or intravenously (iv), decreased infarct volume by more than 50% in both transient (1 h) and permanent occlusion models. The infarct reducing effects of pyruvate were maintained for 14 days after MCAO. Interestingly, higher doses failed to reduce the infarct size. Pyruvate administration also reduced motor deficits. Magnetic resonance (MR) spectroscopy revealed that protective doses of pyruvate, but not the non-protective doses, were associated with a reduction in the level of lactate compared with saline controls. Diffusion-weighted MR images further confirmed infarct reduction in pyruvate-treated rats. Since S478A-tPA lacks protease activity, which has been implicated in causing cerebral hemorrhage or aggravating excitotoxicity, its parenchymal neuroprotective effect may be useful in treatment of ischemic stroke. In addition, pyruvate is an endogenous metabolite of glycolysis, and hence is unlikely to have serious side effects. The combined use of a neuroprotective agent would enhance neuron survival and thereby extend the window of opportunity for thrombolytic treatment to potentially benefit more patients.