NANOENGINEERED BIOMIMETIC PLATFORMS FOR CONTROLLING CELL FUNCTION AND TISSUE REGENERATION

Abstract

살아 있는 세포는 화학 및 물리학적 자극 그리고 주변 세포 혹은 세포외기질간의 상호 관계 등 복잡하고 기능적인 미세 환경에 노출되어 있다. 따라서 이러한 미세 환경과 유사한 혹은 똑같은 조건을 가지고 있는 플랫폼의 개발은 생물학, 치료 및 진단 연구, 줄기세포 및 재생의학, 질병 모델 개발 등 다양한 인간, 동물 및 식물의 생물학적 응용에 있어 매우 중요하다. 세포는 미세 환경 내 콜라겐, 엘라스틴 등의 마이크로 및 나노미터 수준의 고분자 파이버 형태로 구성되어 있는 세포외기질 및 특이적 조직 구조에 둘러 쌓여 있으며 이는 세포의 기능적 조절에 있어 구조적 자극의 중요성을 일러 준다. 하지만 화학 및 물리학적 자극에 따른 세포의 기능적 이해 및 응용에 대한 연구에 비해서 세포 외기질 혹은 조직 내 특이적 구조 자극에 따른 세포의 기능적 이해는 거의 되어 있지 않다. 즉, 다양한 생물학적 연구 및 응용에 있어서 세포가 노출되어 있는 구조적 자극은 거의 무시되거나 최소화 되고 있는데 이는 세포 미세 환경 내 나노미터 수준의 매우 미세하고 복잡한 형태의 특이적 구조를 지니는 플랫폼 개발에 있어 기술적 한계가 있기 때문이다. 본 학위논문에서는 이러한 한계점을 극복하고자 생체재료 가공기술을 이용하여 특이적 조직 및 세포외기질의 구조적 특성을 가지고 있는 생체모방형 나노구조 플랫폼을 개발하였다. 모세관력 리소그래피, 나노물질 등을 활용한 다양한 나노기술에 기반하여 살아 있는 세포에게 생체 내 구조적 자극과 유사한 환경을 제공해 줄 수 있는 플랫폼을 개발하고, 이를 응용하여 세포 기능을 조절하거나 촉진 그리고 조직을 재생 시킬 수 있는 기술을 개발하였다. 이에 따른 본 논문의 구체적인 목적은 다음과 같다. (1) 세포 기능 조절 및 촉진을 위한 형태가 정밀하게 컨트롤된 생체모방형 나노구조 플랫폼 개발, (2) 세포 기능 촉진 및 생물학적 현상에 있어 나노구조의 역할 구명, (3) 복잡한 수술적 치료 없이도 조직을 재생 시킬 수 있는 생체모방형 나노구조 시스템 개발. 이를 위해서 본 논문은 3개의 파트 내 7개의 독립적인 연구로 구성되었으며 본 논문의 주요 결과는 다음과 같다. 첫 번째 파트 연구에서 모세관력 리소그래피 기술 기반으로 다양한 나노미터 사이즈와 함께 일렬로 배열되어 있는 특이적 조직 및 세포외기질 구조를 모방한 세포 배양 플랫폼을 개발하였다. 개발한 나노구조 플랫폼을 응용하여 세포의 구조 및 기능이 나노구조의 밀도에 매우 민감하게 반응함을 규명하였고, 플랫폼 내 구성되어 있는 나노구조 밀도의 최적화에 따라 상처 치유, 줄기세포 분화 등 세포 기능을 촉진 시킬 수 있음을 증명하였다. 두 번째 파트 연구에서는 마이크로 및 나노미터 혹은 다양한 나노미터 사이즈를 동시에 가지고 있는 조직 및 세포외기질의 계층 구조를 모방한 세포 배양 플랫폼을 개발하였다. 모세관력 리소그래피 및 마이크로 표면주름 구조 기술을 응용하여 마이크로 및 나노구조가 계층적으로 정밀하게 컨트롤된 플랫폼을 제작하였고, 이를 통하여 나노구조가 세포-지지체 및 세포-세포간 상호 관계를 조절하고 이에 따라 세포의 기능을 촉진 시킬 수 있음을 구명하였다. 또한 모세관력 리소그래피 기술 기반에 나노물질인 그래핀을 이용하여 수백 나노 및 수십 나노미터 구조를 동시에 가지고 있는 플랫폼을 개발하여 구조적 자극에 따라서 세포의 기능을 더욱더 촉진 시킬 수 있음을 증명하였다. 마지막 세 번째 파트 연구에선 생체모방형 나노구조 플랫폼과 세포 미세 환경 내 다양한 화학적 물질과 세포가 시스템으로 구성되었을 때 세포의 기능 촉진을 극대화 시킬 수 있고, 이 시스템적 관점에 따라 손상된 조직의 치료 및 재생을 시킬 수 있음을 제안하였다. 뼈 조직 내 혈관이 함께 존재함에 영감을 얻어 세포외기질을 모방한 세포 배양 플랫폼에 줄기세포와 혈관세포를 동시에 배양하였고, 이에 따라 줄기세포의 골세포로의 분화가 더욱더 촉진 될 수 있음을 보였다. 본 연구에 기반을 두어 생체적합성 물질로 구성되어 있는 생체모방형 나노구조 플랫폼과 줄기세포가 결합되어 있는 줄기세포 패치를 개발하였고, 이를 이용하여 손상된 뼈를 수술적 치료 없이 재생 시킬 수 있음을 동물모델을 통하여 증명하였다. 또한 박테리아를 이용하여 개발한 셀룰로오스 나노구조 패치를 이용하여 천공된 고막 재생을 촉진 시킬 수 있음을 보였다. 결론적으로, 본 학위논문에선 나노공학 및 생체모방학적 접근법을 통하여 생체모방형 나노구조 플랫폼을 개발하였고 이의 세포 기능 조절 및 촉진 그리고 조직 재생을 위한 공학적 도구로서의 가능성을 제시하였다. 본 연구를 통하여 개발된 나노구조 개발 기술은 다양한 생체재료 및 생물재료의 나노 및 마이크로미터 수준의 미세가공 기술 개발에 응용 할 수 있을 것이며, 인간 혹은 동물의 질병 모델, 진단 및 치료 개발 등 다양한 생물학적 응용에 기여할 수 있을 것으로 기대된다.

Living cells are exposed to complex and functional microenvironment including soluble macromolecules, biophysical cues, and interactions between cell-cell and cell-extracellular matrix (ECM), suggesting that the design and manipulation of engineered cellular microenvironments is of great important in a wide variety of biological applications such as fundamental biology, therapeutic and diagnostic research, stem cells and regenerative medicine, and developing in vitro disease models. Compared with the effects of soluble macromolecules and biophysical cues, the extent and importance of architecture of ECMs in defining cellular function is currently poorly understood in spite of the essential fact that living cells display high sensitivity to the ECM composed of complex and well-defined topographies in protein fibers such as fibrillar collagens and elastins with feature sizes ranging from tens to several hundreds of nanometers in vivo. Namely, the architecture effects of ECMs are mainly neglected or minimized as a considering factor for most in vitro and in vivo experimentation. In this dissertation, we developed a series of advanced nanopatterned platforms inspired by the unique architectures of native tissues and ECMs in a detailed and comprehensive fashion using nanofabrication technologies such as capillary force lithography (CFL) to provide cells the in vivo-like topographical cell environment. Using the nanoengineered biomimetic platforms, the roles of nanotopography in regulation of cellular and multicellular structure and function were investigated. We also utilized the biomimetic systems composed of a nanoengineered substrate, specific soluble macromolecules, and cells to achieve desired phenotypic responses toward tissue regeneration. The specific aims of my thesis are as follows are: (1) to design and manipulate nanotopographically defined platforms with precisely controlled topographical architectures as a synthetic ECM for regulating structure and function of cells in single (i.e., single adherent cells) and multi-cellular (i.e., cohesive groups of cells) levels, (2) to investigate the detailed role of nanotopography in cellular behavior for developing a methodology for promoting cell function and modeling biological processing such as stem cell differentiation and would repair, and (3) to develop a strategy for tissue regeneration such as bone and tympanic membrane using nanoengineered biomimetic systems. The working hypothesis underlying my research is that nanoengineered biomimetic platforms can (i) provide cells in vivo-like topographical cues that control cellular and multicellular structure and function, and (ii) allow appropriate environments for repair or regeneration of damaged tissues without surgical treatments. The main results of my dissertation research can be summarized as follows. First, inspired by the architectures of native ECMs in various tissues, nanotopographically defined ridge/groove patterned substrata with precisely controlled sizes were developed using CFL. Using these platforms, it was found that nanotopographical density can control the morphology, focal adhesion formation, migration, ECM molecule production of fibroblast cells, and would healing as well as the adhesion, migration, and differentiation of mesenchymal stem cells (MSCs). Second, nanopatterned hierarchical platforms (i.e., multiscale topography) were developed for better mimicking architectures of ECMs using CFL in combination with micro wrinkling technique and nanomaterials. Using anisotropically multiscale patterned substrata with precisely defined micro- and nanotopography, the potential role of nanotopography in ECMs were investigated

the nanotopography can regulate the cell-substrate or cell-cell interactions, which may eventually promote the function of cells including NIH3T3 fibroblast cells, MG-63 cells, and MSCs. Furthermore, it was found that graphene-matrix nanotopography hybrid substrata with nano and sub-nanopatterned hierarchical features can promote the functions of cells including differentiation of MSCs, enhanced mineralization of MC-3T3 cells, and capillary tube formation of HUVEC. Finally, nanoengineered biomimetic systems composed of the ECM-like topographical substrate, chemical molecules, and cells were proposed as a strategy for repair or regeneration of damaged tissues. Inspired by the aligned nanostructures and co-existence of vascular cells and stem cells in bone tissues, the systems comprised of nanotopography and co-culture platforms were developed, showing that the osteogenesis of MSCs was further enhanced by the two factors in combination whereas both nanotopography and co-culture independently enhanced the osteogenesis. In addition, a stem cell patch that integrates MSCs into the nanopatterned hierarchical substrate was developed using a Food and Drug Administration (FDA)-approved poly(lacticco-glycolic acid) (PLGA) polymer. It was demonstrated that the nanopatterned stem cell patches can guide the bone regeneration and the nanofibrillar patch synthesized from bacterial cellulose can promote the tympanic membrane regeneration without complex surgical treatments or tissue transplantation.