Single-Molecule FRET Studies on Z-DNA

Abstract

지난 20세기 동안 생물학은 많은 발전을 이루어 왔다. 특히 1953년 왓슨과 크릭이 모든 생명체의 유전정보를 담고 있는 DNA의 구조를 밝혀냄으로써 <분자생물학>이라는 새로운 장이 열리게 되었다. 왓슨과 크릭이 제안한 DNA의 구조를 보면 (B-DNA라고도 불린다) 이중나선형태를 지녔는데 그 방향이 오른나선 방향이다. 이러한 구조는 이후 다양한 연구를 통해 검증이 되었다.

그런데 1979년 알렉산더 리치 그룹이 밝혀낸 DNA에 대한 최초의 크리스탈 구조를 보면 놀랍게도 오른나선이 아닌 왼나선의 DNA 이중구조였다 (이름을 Z-DNA라고 지었는데, 이는 백본의 형태가 지그재그여서 붙여졌다). Z-DNA의 구조를 보면 B-DNA와는 다른 점들이 많이 있다. Z-DNA는 이중나선의 방향이 왼나선이고, B-DNA에 비해 전체적으로 가늘고 긴 구조를 가지고 있다. Z-DNA는 보통의 생리학 조건에서는 거의 존재하지 않는데, 높은 농도의 이온이나 (-) supercoiling, DNA 염기의 조작, 그리고 특정 단백질이 있는 조건에서 쉽게 만들어 진다고 알려져 있다. Z-DNA가 발견된 이후 30 여년 동안 생물학적 역할에 대해 많은 연구가 이루어져 왔는데, 유전 조절과정에서 시작부분 그리고 뉴클레오솜의 위치변경 과정이나 유전자 불안정에 영향을 미치는 것으로 밝혀졌다.

Z-DNA에 대한 연구는 기존의 앙상블 실험에서는 한계가 있었다. 실제 Z-DNA는 많은 양의 B-DNA에 둘러 쌓여 있기 때문에 B-DNA의 신호로 인해서 Z-DNA에 대한 신호를 측정하는데 어려움이 있었다. 이를 극복하기 위해 우리는 단일분자 프렛을 이용한 단일분자에 대한 실험을 진행하였다. 우리는 단일분자 수준에서 높은 농도의 이온이나 단백질에 의한 B-Z 변이를 성공적으로 측정할 수 있었고 그 결과 다음과 같은 점들을 밝혀내었다.

1) 우리는 단일분자 프렛과 원평광 이색성을 이용하여 여러 가지 종류의 이온들에 대해서 Z-DNA 유도 능력을 측정하였다. 그 결과 기존에 높은 농도 조건에서 Z-DNA가 잘 생겨나는 이유로 널리 알려진 <정전기 가로막기> 효과와는 다르게, 호프마이스터 효과에 따라 Z-DNA가 잘 유도된다는 사실을 밝혀냈다.

2) 우리는 단일분자 프렛을 이용하여 본래적으로 존재하는 B-Z 변이과정과 단백질의 결합/분리 과정을 측정할 수 있었다. 이 결과 단백질에 의한 B-Z 변이는 능동적으로 유도 되는게 아니라, 단백질은 단지 수동적으로 본래적으로 생기는 Z-DNA에 잘 결합해서 Z-DNA를 안정화시킨다는 것을 밝혀냈다.

3) 우리는 DNA 뿐 아니라, RNA와 DNA, RNA가 결합한 하이브리드 형태의 샘플에 대해 단백질에 의한 Z-형태의 구조가 생겨나는 것을 관측하는데 성공하였다. 그 결과 DNA, RNA가 결합한 하이브리드 형태의 샘플이 다른 DNA와 RNA에 비해 더 빠르고 더 잘 Z-형태의 구조로 잘 변한다는 사실을 밝혀냈다. 이 결과로부터 모델을 세워, (시토신-구아닌) 반복 염기와 정션이 미치는 영향에 대해 각각 계산을 해내었다. 결과적으로 DNA, RNA가 결합한 하이브리드 형태의 샘플이 Z-형태의 구조로 가장 잘 변한다는 이유는 정션에서의 자유에너지 장벽이 제일 낮기 때문으로 드러났다.

It has been advanced to study biology in a molecular level for the last century. Especially, a new field Molecular Biology appeared after Watson and Crick proposed the DNAs helical structure in 1953. DNA structure which Watson and Crick proposed was called B-formed DNA and it was built up the right-handed double helical structure. This structure had been confirmed by many different studies and became realistic. However, in 1979, not right handed DNA but left handed DNA ( Z-DNA, named by zigzag backbone structure) was observed in the first atomic resolution view of the double helix by A. Rich group. Unlike B-DNA, Z-DNA had many different things. The helical structure of Z-DNA was left-handed and Z-DNA was thinner and more extended than B-DNA. While Z-DNA is formed with a very brief lifetime under normal conditions, it has been known that various factors such as high salt concentration, negative supercoiling, chemical modifications of bases, and Z-DNA binding proteins can make the threshold salt concentration for B-to-Z transition goes down to physiological levels. From enormous experimental data accumulated over the past 30 years, Z-DNA is thought to play fundamental roles such as regulatory at the transcriptional step, nucleosome positioning, and genetic instability. In previous ensemble studies, a little portion of Z-DNA surrounded with B-DNA at each side was limited to measure due to large signal of B-DNA. Therefore, studies of Z-DNA with BZ junction was rare. To overcome this problem, we employed single-molecule FRET assay and was successful to distinguish B-DNA and Z-DNA. From this assay, we were able to observe B-to-Z transition with high salt and Z-DNA binding protein. In this paper,

i) We examined the Z-DNA stabilizing capabilities of different salts by using single-molecule experiments along with circular dichroism measurements. Contrasted to the prediction of the widely accepted model of electrostatic screening, strong correlation between the degree of helix-to-coil transition and B-to-Z transition revealed that B-to-Z transition follows the Hofmeister series. And we also measured energetics of salt-induced Z-DNA formation. As a result, surprisingly, the effect of BZ junction was so dramatic that thermodynamic properties were inverted in whole when BZ junction was added, e.g. enthalpic term helped B-DNA to transform to Z-DNA and entropic term hindered the B-to-Z transition if there was no BZ junction, but entropic term helped B-to-Z transition with BZ junction.

ii) We were able to observe intrinsic B-Z transitions, protein association/dissociation events. These results revealed that intrinsic B-Z transitions were dynamically formed and Z-DNA was effectively stabilized by Z-DNA binding proteins through passive role of protein, rather than active role of it. Our study provided, for the first time, detailed pictures of the intrinsic B-Z transition dynamics and protein-induced B-to-Z transition mechanism at the single molecule level.

iii) We successfully measured equilibrium constant of double-stranded (ds) DNA, dsRNA, DNA-RNA hybrid sample at various temperature. From fitting with vant Hoff equation, we calculated enthalpic and entropic change of B-Z transition as well as free energy. From these results, we proposed linear model system and calculated energy of (CG) and junction at each. As a result, hybrid sample was fastest and easiest to transform to Z-form due to lower junction free energy barrier. It meant that substrate of so-called Z-DNA binding protein might be RNA or hybrid as well as DNA.