Genome-wide analysis of hepatocellular carcinoma cell lines by next-generation sequencing

Abstract

간세포암은 간암의 가장 대표적인 종류이며, 전세계 암 관련 사망률의 주요 원인 중 하나이다. 간세포암의 대부분의 경우는 B 형과 C 형 간염 바이러스에 의한 감염과, 알코올로 인한 간경화가 주요 원인이 되고 있음이 보고되었으나, 유전체 변이에 의한 발암 기전은 명확히 밝혀져 있지 않다. 최근에는 진행성 간세포암에 있어서 다중 타이로신 키나아제 저해제인 소라페닙이 유일한 표적치료제를 사용한 표준 치료법으로 승인되었으나 생존 기간을 2 개월 가량 연장하는 데에 그치고 있는 실정이다. 따라서 간세포암에 대한 새로운 표적과 이에 대한 표적 치료제를 개발하는 것이 절실히 필요하다. 그러므로 본 연구에서는 간세포암에서 새로운 유전체 수준의 변이를 찾아내고, 그에 따른 표적 치료 타깃으로서의 적용 가능성을 규명하고자 하였다. 최근 차세대 염기서열 분석법의 개발로 인해 다양한 암종에 대한 유전체 분석을 통하여 암 유전체 변이에 대한 통합적인 분석이 가능해졌으며, 또한 암세포 특이적 유전자 변이의 존재가 밝혀지고 있는 실정이다. 본 연구에서는 차세대 염기서열 분석법을 이용하여 간세포암 세포주에서의 새로운 유전체 변이를 찾기 위해 B형, C형 바이러스 감염과 연관된 한국인 간세포암 10개 세포주를 포함한 총 13 개의 간세포암 세포주를 대상으로 일루미나 사의 Genome Analyzer IIx 장비를 사용하여 전사체 염기서열 분석을 시행하여, 주요 암유전자 (TP53, CTNNB1, CDKNB1, CDKN2A, PTEN, 그리고 NRAS) 의 체세포 돌연변이가 존재하고 있음을 확인하였다. 또한, 간세포암 세포주에서 총 561개의 융합유전자 (205 개의 이질 염색체간 융합유전자와 356개의 동일 염색체간 융합유전자)를 발굴하였으며 이 중, 추가 분석을 통해 총 27개의 이질 염색체간 융합유전자와 7개 (VAMP1-LOC678655, MTG1-LOC619207, LOC283314-CLSTN3, MORC4-RIPPLY1, CNRIP1-PPP3R1, PHRF1-DRD4, NAT15-CLUAP1) 의 동일 염색체간 융합유전자를 검증하였다. 특히C15orf57 (CCDC32) ? CBX3 융합유전자는 SNU-423 세포주를 제외한 모든 간세포암 세포주에서 확인되었으며, SNU-368세포주에서의 IGF2BP2-TFEB와 Hep3B세포주에서의 B2M-SQSTM1 (p62) 융합유전자 등이 quantitative real-time PCR과 Sanger sequencing, 그리고 Western blotting 실험을 통해 검증되었다. 이러한 융합유전자들에 대해 추가로 원발성 간세포암 환자 조직으로부터 얻은 샘플을 통해 발생 빈도를 확인한 결과, 간세포암 조직에서 정상보다 높은 비율로 융합유전자들이 검출되고 있음을 확인하였다. 흥미로운 것은, 알파태아단백 (AFP) 유전자가 많은 다른 유전자들과 융합을 이루고 있음을 확인할 수 있었으며, 이러한 양상은 SNU-16 위암 세포주에서 PVT1 유전자가 여러 개의 짝과 융합유전자를 이루고 있는 것과 유사한 양상을 보였다. 그 다음으로, 11개 간세포암 세포주를 대상으로 차세대 염기서열 분석방법의 또 다른 방식인 타깃 유전자 염기서열 분석을 암 관련 183개 유전자를 선정하여 진행하였다. 타깃 염기서열 분석결과, 87개 유전자에서 329개의 분자유전학적 변이가 확인되었다. 또한 CCND1 유전자의 복제 수 변이 또한 간세포암 세포주에서 확인되었다. 전사체 염기서열 분석 결과와 타깃 유전자 염기서열 분석결과를 통합 분석하여, 새로운 RNA 편집 유전자를 찾을 수 있었다. 그 중, CHEK2 유전자의 RNA 편집은 Sanger sequencing으로 확인되었고, 기 보고된 논문 자료와의 메타분석을 통해 GLUD2 유전자의 RNA 편집 (A to I) 은 Sanger sequencing과 inosine chemical erasing (ICE) 실험을 통해 검증되었다. 마지막으로, 한국인 간세포암 10개 세포주를 대상으로 16 가지의 분자표적항암제에 대한 항암제 감수성 평가를 수행하였다. 그 중, PI3K/mTOR 저해제인 BEZ-235의 경우 SNU-398, SNU-423, SNU-739, SNU-761 그리고 SNU-886 세포주에서 높은 항암제 감수성을 보여주었음을 확인하였다. 또한 MET 저해제인 crizotinib의 경우 SNU-398, SNU-739 세포주에서 다른 세포주와 비교하여 감수성의 높음을 관찰하였으며, 최근 개발된 또 다른 MET inhibitor인 tivantinib의 경우 SNU-739 세포주에서만 높은 감수성을 확인할 수 있었다. 그 분자기전은 확인할 수 없으나 새로운 치료 타깃으로서의 가능성을 확인할 수 있었다. 요약하면, 본 연구에서는 전사체 염기서열 분석과 암 관련 유전자에 대한 타깃 유전자 염기서열 분석을 통해 한국인 간세포암 10개 세포주를 포함한 총 13개 간세포암 세포주의 새로운 유전체 변이를 찾아내었으며, 그에 따른 표적 치료 타깃으로서의 적용가능성을 제시하였으며, 특히 돌연변이 연구와 복제 수 변이 등의 연구에 정확하고 효과적인 결과를 도출할 수 있음을 확인하였다. 아울러 본 연구에서 새로이 밝혀진 여러 유전체 변이 결과를 통하여 간세포암의 유전적 변이에 대한 유전체, 전사체 수준의 정보를 획득함으로써 간세포암에 대한 분자유전학적인 이해를 증대시켜 후속 연구에 활용할 수 있을 것이며, 또한 간세포암에 대한 유전체 수준의 생물학적 이해를 도울 수 있기를 기대하며, 분자수준의 특징을 고려한 개인 맞춤 치료법 개발의 지표로 사용할 수 있을 것이라 생각된다.

Hepatocellular carcinoma (HCC) is the most common type of liver cancer and one of the major causes of cancer-related deaths worldwide. Most cases of HCC are secondary to either a viral hepatitis infection (hepatitis B or C) or cirrhosis (alcoholism being the most common cause of hepatic cirrhosis). Although sorafenib, a multi-tyrosine kinase inhibitor, was approved as a standard therapy for advanced HCC, its impact on survival is not apparent. Furthermore, molecular mechanisms of carcinogenesis in HCC are not clearly determined yet. Recent advances in next-generation sequencing (NGS) technology have allowed comprehensive profiling of genetic alterations in cancer. In this study, we plan to identify the genetic characteristics of HCC based on targeted sequencing and whole-transcriptome analysis of 13 HCC cell lines related to hepatitis B or C virus (HBV or HCV) infections using the Illumina Genome Analyzer IIx. In targeted sequencing for 183 cancer-related genes, we identified driver somatic mutations in cancer genes including TP53, CTNNB1, CDKNB1, CDKN2A, PTEN, and NRAS. One of the advantages of transcriptome sequencing over genome sequencing is the availability of detecting transcriptional variants, such as fusion genes and alternative splicing events. A total of 561 fusion genes (205 inter-chromosomal, 356 intra-chromosomal) were detected in the HCC cell lines using the transcriptome data. Of these, through additional filtration steps, 34 candidate events were validated: 27 inter- and seven intra-chromosomal fusions. Chromosome 15 open reading frame 57 (C15orf57

also known as coiled-coil domain containing 32-CCDC32) to chromobox homolog 3 (CBX3) fusion transcript was detected in all HCC cell lines, with the exception of SNU-423. In addition, insulin-like growth factor 2 mRNA binding protein 2 to transcription factor EB (IGF2BP2-TFEB) (in SNU-368) and beta2-microglobulin to sequestosome (B2M-SQSTM1) (in Hep3B) fusion transcripts were validated by quantitative real-time PCR, Sanger sequencing, and Western blotting. Among 38 primary HCC tissues (20 tumor, 18 matched normal), each fusion transcript was detected more often than matched normal tissues. Interestingly, alpha-fetoprotein (AFP) was the gene associated with the highest number of partner genes. Next, we established a set of 183 cancer-related genes for targeted sequencing. A total of 329 somatic sequence variations were found in 87 genes across 11 HCC cell lines. Four indels were validated using Sanger sequencing including TP53. Using the coverage data, we could also detect copy number alterations of CCND1. By comparing whole-transcriptome and targeted sequence data, we were able to discover novel RNA editing sites. Among them, checkpoint kinase 2 (CHEK2) RNA editing was also validated using Sanger sequencing. In addition, by comparing previously reported RNA editing sites, glutamate dehydrogenase 2 (GLUD2) editing sites were identified and validated by Sanger sequencing and inosine chemical erasing (ICE) assay. Finally, we evaluated the drug sensitivity of 16 molecular target agents. Among them, we found that the PI3K/mTOR inhibitor, BEZ235, was highly sensitive in HCC cell lines, especially SNU-886. Even if the mechanism of mesenchymal epithelial transition factor (MET) in HCC remains elusive, there is some evidence that suggests MET could be considered an interesting target in HCC. In conclusion, transcriptome sequencing and targeted sequencing of cancer-related genes can be an accurate and efficient method for studying mutations and copy number variations. Moreover, investigational therapies with their molecular characteristics can reveal those biomarkers that can be used to guide clinical trials. I hope that these studies can provide us with better insight into understanding HCC biology and personalized therapy in the near future.