Molecular mechanisms for polarized distribution of NCKX2 in rat hippocampal neurons

Abstract

K+의존적 Na+/Ca2+ exchanger (NCKX)는 중추신경계 축삭 말단에서 중요한 칼슘 제거 기전이지만, 세포체에서는 NCKX의 활성이 거의 없다고 알려져 있다. 본 논문에서는 쥐의 해마 신경 세포에서 NCKX2가 축삭 표면에 특이적으로 분포하는 기전을 연구하였다. 이 연구에서 NCKX2를 kinesin family member 21A (KIF21A)의 신경 세포 특이적 cargo 단백질로서는 처음으로 동정하였고, NCKX2의 세포내측 부위가 KIF21A의 cargo 결합 도메인으로 추측되는 WD-40 repeat과 상호 결합함을 밝혔다. KIF21A의 우성음성 돌연변이체 (dominant-negative)나 RNA 간섭 (RNAi)을 이용한 KIF21A의 결핍은 NCKX2-GFP의 축삭 수송을 억제한다. 또한 KIF21A의 결핍 (knockdown)은 축삭 말단에서의 칼슘 조절 장애를 야기하지만, 세포체나 수상돌기에서의 칼슘 조절에는 영향이 없었다. NCKX 활성이 축삭 특이적으로 나타남에도 불구하고, NCKX2를 면역염색 해보면 세포체/수상돌기 부분과 축삭 모두에 염색이 된다. 하지만 살아있는 세포에 항체를 표지하여 세포막에 발현된 NCKX2만을 관찰해보면, NCKX2의 세포막 발현이 축삭에 치우쳐 분포하고 있음을 알 수 있다. 해마 신경 세포에 dynamin 억제제인 dynasore를 처리하거나 dynamin-1의 K44A 돌연변이체를 과발현시켜서 endocytosis를 막으면, 세포체와 수상돌기 표면에서 NCKX2의 발현이 증가한다. 뿐만 아니라, 해마 치상회절 과립 세포 (dentate granule cell)의 수상돌기에서 dynasore에 의해 NCKX 활성이 증가하였다. AP-2 단백질의 μ2 단위체가 tyrosine motif (YxxΦ)와 결합하면 clathrin-mediated endocytosis가 개시된다는 것이 잘 알려져있다. NCKX2의 세포내측 부위에는 tyrosine motif로 추정되는 서열이 두 곳 존재한다 (365YGKL, 371YDTM). 먼저 NCKX2가 μ2와 상호작용하는지 알아보기 위하여 면역침전을 수행해본 결과 wild type NCKX2는 μ2와 결합하지만, NCKX2의 Y365A 돌연변이체는 μ2와 상호작용하지 않았다. 반면, Y371A 돌연변이는 NCKX2와 μ2의 상호작용에 거의 영향을 미치지 않았는데, 이는 NCKX2의 365YGKL motif가 μ2와의 결합에 필요함을 시사한다. 다음으로 365YGKL motif가 NCKX2의 endocytosis에 필요한지를 알아보았다. 세포막에 발현하는 Wild type NCKX2를 관찰해보면 주로 축삭에 분포하고 있지만, NCKX2의 endocytosis는 축삭 보다는 세포체와 수상돌기 부분에서 더 활발히 일어난다. 하지만 NCKX2의 Y365A 돌연변이체는 endocytosis가 잘 되지 않고 세포막 발현도 축삭 특이적이지 않다. 또한 μ2 단위체가 결핍되면 wild type NCKX2 조차도 endocytosis가 억제되고, 세포막 발현의 축삭 특이성도 감소한다. 본 연구에서는 NCKX2의 365YGKL motif와 μ2의 결합이 인산화를 통하여 조절될 것이라는 가설을 세우고 다음 실험을 수행하였다. 세포에 carbachol (CCh)을 처리하면 PYK2를 통하여 Src family kinase (SFK)가 활성화된다는 것이 알려져있다. NCKX2의 Tyr-365가 CCh 처리에 의해 인산화되었고, 이러한 CCh에 의해 유발된 NCKX2의 인산화는 SFK 저해제인 PP2에 의해 감소하였다. PP2를 전처리하고 NCKX2를 면역염색 했을 때, 특히 축삭에서 endocytosis가 현저히 증가하였다. SFK 활성화 펩타이드에 의해 해마 치상회절 과립 세포의 수상돌기에서 NCKX 활성이 증가하였다. 이러한 결과들은, KIF21A를 매개한 축삭 수송과 세포체/수상돌기 부분의 선택적 endocytosis가 NCKX2의 세포막 발현을 축삭에 치우치게 하고, 세포체/수상돌기 부위에서 일어나는 NCKX2의 endocytosis는 SFK 신호 전달 과정과 AP-2를 매개함을 시사한다.

K+-dependent Na+/Ca2+ exchanger (NCKX) is a major calcium clearance mechanism at the large axon terminals of central neurons, whereas their somata display little NCKX activity. I investigated mechanisms underlying the axonal polarization of NCKX2 in rat hippocampal neurons. I identified NCKX2 as the first neuron-specific cargo molecule of kinesin family member 21A (KIF21A). The intracellular loop of NCKX2 (NCKX2-loop) specifically interacted with the WD-40 repeats, a putative cargo-binding domain, of KIF21A. Dominant negative mutant or depletion of KIF21A inhibited the transport of NCKX2-GFP to axon fibers. Knockdown of KIF21A caused calcium dysregulation at axonal boutons but not at somatodendritic regions. Despite the axonal polarization of the NCKX activity, both somatodendritic and axonal regions were immunoreactive to NCKX2. The surface expression of NCKX2 revealed by live-cell immunocytochemistry, however, displayed highly polarized distribution to the axon. In cultured hippocampal neurons, surface expression of NCKX2 on the somatodendritic compartment was significantly increased when endocytosis was suppressed by treating a dynamin inhibitor, dynasore, or overexpression of dynamin-1 mutant (DYN1-K44A). Moreover, dynasore increased NCKX activity at proximal dendrites of hippocampal dentate granule cells (GCs). It is well known that the μ2 subunit of AP-2 interacts with the canonical tyrosine motif (YxxΦ) and initiates the clathrin-mediated endocytosis. NCKX2 has two putative tyrosine motifs (365YGKL and 371YDTM) in its cytoplasmic loop region. First, I investigated whether NCKX2 interacts with the μ2 subunit in a heterologous expression system. NCKX2-loop was coimmunoprecipitated with the μ2, but the Y365A mutant of NCKX2-loop was not. In contrast, the interaction between μ2 and NCKX2-loop was little affected by the mutation of Y371A, suggesting that the 365YGKL motif is essential for interacting with the μ2 subunit. Next, I investigated whether the 365YGKL motif is essential for the endocytosis of NCKX2. Although the surface expression of NCKX2 was polarized to axon, the immunoreactivity of internalized NCKX2 was stronger in the somatodendritic region than the axon. Exogenous NCKX2-Y365A was little internalized and exhibited no axonal polarization of its surface expression. Furthermore, knock-down of the μ2 subunit blocked the endocytosis of wild-type NCKX2 and significantly reduced the axonal polarization of its surface expression. I hypothesized that interaction between 365YGKL motif of NCKX2 and μ2 subunit is regulated by phosphorylation. Tyr-365 of NCKX2 was phosphorylated by carbachol which is known to activate Src family kinase (SFK) through PYK2. Furthermore, applying SFK-activating peptide increased NCKX activity at proximal dendrites of hippocampal dentate GCs. These results indicate that KIF21A-mediated axonal transport and selective somatodendritic endocytosis underlie the axonal polarized surface expression of NCKX2 and the endocytosis of NCKX2 in the somatodendritic region is mediated by SFK signaling pathway and AP-2.