H9c2 심근세포에서 doxorubicin에 의해 유발된 세포자멸사에 대한 clusterin의 보호 효과

Abstract

서론: Doxorubicin(DOX)은 혈액암과 고형암의 치료에 근간이 되는 유용한 항암제이지만, 비가역적인 심근 독성으로 인해 사용이 제한되고 있다. Clusterin은 다양한 조직과 체액에서 발현되는 당단백질로서, 다양한 생리적 및 병적 스트레스 상황에서 세포를 보호하는 chaperone 역할을 수행한다. 본 연구는 백서의 심실조직과 H9c2 심근세포에서 DOX의 투여에 의해 clusterin의 발현이 상향조절 되는지 확인하고, clusterin이 DOX에 의해 초래되는 세포자멸사에 보호효과를 나타내는지 알아보기 위해 시행되었다. 방법: H9c2 심근세포에 DOX을 처치한 뒤 clusterin 발현의 변화를 western blot 분석을 통해 측정하였다. Clusterin이 세포 생존에 미치는 영향을 알아보기 위해 H9c2세포에 pcDNA3/hCLU를 유전자핵내주입하여 clusterin을 과발현시키는 H9c2/hCLU 심근세포를 제작하였다. H9c2/hCLU 심근세포와 H9c2 심근세포에 DOX을 처치하고, 두 군간의 세포생존율의 차이를 trypan blue 염색과 DAPI 염색을 통해 비교하였다. DOX을 처치한 두 세포군간에 세포자멸사의 공통경로인 cleaved casepase-3의 활성을 western blot 분석을 통해 측정하여 비교하였다. 8주령의 Spargue-Dawley 백서(30.7±2.7g)에게 DOX(2.5mg/kg, 실험군)과 식염수(대조군)를 각각 3일간격으로 18일간 복강 내로 주입하여 심근증을 유발하고, 23일째에 희생시켰다. 백서의 심장조직에 대해 hematoxylin-eosin 염색, Masson's trichrome 염색을 시행하고, 심장 조직의 세포자멸사를 관찰하기 위해 TUNEL 분석과 caspase-3에 대한 면역조직화학염색을 시행하였다. 면역조직화학염색 및 면역형광염색을 통해 두 군의 심장조직에서 clusterin의 발현양상에 차이가 나타나는지 관찰하였다. 결과: H9c2 심근세포에 DOX을 처치하였더니 세포 lysate와 세포농축액 내에 clusterin의 발현이 증가하였다. 두 군에 DOX을 투여하고 trypan blue 염색을 시행하였더니 H9c2/hCLU 심근세포는 H9c2세포에 비해 DOX의 투여에 대해 세포 생존율이 유의하게 향상되었다(58.3±10.4% vs 78.4 ±1.23%, P<0.003). DAPI 염색에서 H9c2/hCLU 심근세포는 H9c2 심근세포에 비해 DOX에 의한 염색질의 분절과 세포핵의 응축 소견이 감소하였다. Western blot 분석에서 clusterin이 과발현 된 H9c2/hCLU 심근세포는 DOX 투여에 의한 caspase-3 활성이 H9c2 심근세포에 비해 감소되었다. 백서에게 DOX을 투여하면 백서의 심실근육세포의 세포질 내에 clusterin이 발현되는 것이 면역조직화학염색을 통해 확인되었다. 결론: DOX에 의한 손상자극에 대해 H9c2 심근세포와 백서의 심실근육세포는 세포질 내에 분비성 clusterin의 발현을 증가시킨다. H9c2/hCLU 심근세포모델에서 clusterin의 과발현은 DOX에 의한 세포사로부터 세포를 보호하는 효과를 나타내고, clusterin의 세포보호효과에는 세포자멸사의 공통경로인 caspase-3의 활성을 억제시키는 것이 하나의 기전으로 작용한다.