Inhibitory roles of the lysyl-acetyltransferase ARD1 in bone development and regeneration

Abstract

배경: 전사인자인 Runt-related transcription factor 2 (Runx2)는골형성과 조골세포 분화에 관련된 많은 유전자들을 조절한다. Runx2는 단백질의 번역후 수정 (post-translational modification) 과정을 통해 단백질 안정성과 전사활성이 조절된다. Runx2의 번역후 수정 중 하나인 아세틸 수식은 Runx2의 전사활성 조절 중 알려진 유일한 원인이다. Runx2의 직접적인 아세틸 수식 인자로는 p300과 PCAF만이 알려져 있으나, 표적 잔기가 명확히 알려져 있지 않다. 한편, 아세틸화 효소인 arrest defective-1 (ARD1)은 효모에서 세포성장과 포자형성에 결정적인 역할을 하며, 포유류 암세포에서도 아미노산 lysine을 아세틸 수식하여 HIF-1a, b-catenin, MLCK등의 단백질 기능의 조절한다. 포유류 단백질 대부분이 아세틸 수식을 통해 단백질 기능과 안정성 조절을 받으며, 이를 ARD1이 조절할 것이라 예상한다. 하지만 뼈에서의 ARD1의 발생과 역할은 전혀 밝혀지지 않았다. 본 연구에서는 ARD1이 아세틸 수식을 통해 Runx2의 신호전달과 골 형성에서 역할을 연구하였다. 결과: BMP-2의존적인 조골세포 분화 동안, ARD1과 Runx2의 단백질 수준이 함께 증가하였다. IKKb는 ARD1의 serine 206 잔기를 인산화시켜 프로테아좀 분해시키는 것으로 알려진 효소이다. 조골세포 분화 동안 Runx2는 IKKb의발현을억제함으로써ARD1의 단백질을 안정화시켰다. ARD1 억제 시 Runx2의 전사 활성이 촉진되어 조골세포 분화가 증가되었다. 이는 ARD1이 Runx2의 억제성 되먹임 조절자가 될 수 있음을 제시한다. 동물 모델에서, ARD1억제시 쥐의 머리덮개 뼈의 결손 부분에서 골 재형성이 증가되었다. 또한, ARD1 형질전환 쥐에서 대조군에 비해 신생아 머리덮개 뼈의 골형성과 무기질 침착이 지연되었다. 반대로 ARD1 결손 쥐에서는 머리덮개 뼈의 골형성이 촉진되었다. ARD1 에 의한 골형성의 억제 기전은 다음과 같다. ARD1은 Runx2의 DNA 결합 영역으로 알려진 RUNT 영역의 lysine 225 잔기에 아세틸 수식을 했다. Runx2의 lysine 225의 아세틸 수식이 되면, Runx2의 전사 인자 도움 단백질로 알려진 CBFb가 결합하지 못했다. 이를 통해 ARD1은 아세틸 수식을 통한 Runx2의 전사활성을 저해한다. 따라서 ARD1 억제제를 개발한다면, Runx2를 경유하는 골형성과 골재형성을 효과적으로 증가시킬 수 있을 것이다. 결론: ARD1은 Runx2에 의해 조골세포 분화 과정 동안 단백질 안정성이 증가된다. ARD1은 Runx2의 억제성 되먹임 조절자로써 골 형성 기간 동안 Runx2의 전사 활성을 억제하여 조골세포 분화의 속도와 균형을 조절한다. 본 연구는 ARD1이 조골세포에서의 발현과 포유류 골형성에 중요함을 처음으로 규명하였다. ARD1이 골형성과 치유에 관련된 골대사 질환의 새로운 치료 표적이 될 수 있음을 시사한다.

Introduction: Runx2 has a pivotal role of bone formation and osteoblast differentiation. During an early stage of differentiation, Runx2 is upregulated and its activity is fine-tuned by post-translational modification. The lysyl-acetylation is an important modification to regulate Runx2 activity, and it has been known to be mediated by p300 or PCAF. However, which lysine residues in Runx2 are acetylated remains unclear so far. On the other hand, the acetyltransferase arrest defective-1 (ARD1) has been originally identified in Saccharomyces cerevisiae and known to be crucial for yeast growth and sporulation. In mammalian cells, ARD1 has been reported to acetylate the lysine residues of several proteins, such as, hypoxia-inducible factor-1a, b-catenin and myosin light chain kinase. As it is ubiquitously expressed, ARD1 is expected to act more diversely beyond the aforementioned functions. In the present study, it is investigated whether ARD1 participates in the Runx2 signaling pathway and bone formation. Methods & Results: Both ARD1 and Runx2 were induced during bone morphogenic protein 2 (BMP-2) dependent osteoblastogenesis. In osteoblast differentiation, Runx2 suppressed IKKb, which induces the proteasomal degradation of ARD1 by phosphorylating its S206, and by doing so stabilized ARD1. ARD1 inhibition increased osteoblastogenesis by activating Runx2, suggesting that ARD1 acts as a negative feedback regulator of Runx2. ARD1 knock-down augmented BMP-2-induced bone regeneration in rat calvarial defect model. Calvarial bone development at the neonatal stage was delayed in ARD1 transgenic mice. On the contrary, ARD1 knock-out promoted bone formation and mineralization in calvarias of newborn mince. In detailed mechanism, ARD1 was found to acetylate lysine 225 residue in the RUNT domain of Runx2, and this acetylation interfered with CBFb binding to the RUNT domain of Runx2. Accordingly, ARD1 repressed the transcriptional activity of Runx2 and affected inhibition of Runx2-dependent osteoblast differentiation. Conclusions: These results suggest that ARD1 acts as a guard that ensures balanced osteogenesis by fine-tuning Runx2 in a negative feedback manner. Taken together, this study shows that ARD1 has a new function in bone formation and should be considered a therapeutic target to aid bone healing.