New potent inhibitor of necrotic cell death

Abstract

연구 배경 : 허혈 심근을 살리기 위해 심혈관 재관류술은 최선의 치료법이나 역설적으로 그 자체가 오히려 재관류 손상을 유발할 수 있다. 이러한 재관류 손상의 주된 기전으로는 미토콘드리아의 막투과성의 변화와 세포 내부 칼슘 이온의 과부하가 잘 알려져 있으며 이로 인해 세포괴사가 진행하게 된다. 이에 괴사 억제제로 알려진 necroX(necX)를 심근 허혈/재관류 모델에서 전처치하여 세포자멸사가 아닌 세포 괴사를 억제, 재관류 손상을 효과적으로 예방할 수 있는지 밝히고자 하였다. 방법 및 결과 : 심근섬유아세포인 H9C2세포와 백서 태아의 심근모세포를 저산소 환경에서 세포를 배양한 후 necX, 세포자멸사 억제제, 비타민이나 N 아세틸 시스테인과 같은 항산화효과가 있는 약제를 전처치한 후 재산화 손상을 유도하였다. 저산소-재산화 손상에서 necX 투약군이 효과적으로 세포사를 예방하였다. DHR 123 분석을 통해 항산화제로 알려진 타 약제 투여군과 necroX 전처치군을 비교해 보았을 때 necroX 투여군에서 효과적으로 활성화된 산소 라디칼을 제거하고 활성 라디칼에 관여하는 효소들을 억제하는 것을 확인할 수 있었다. 또한 necX 투여군은 재산화 손상 중 미토콘드리아의 막전위와 구조를 유지하고 효과적으로 칼슘의 세포 내 과부하가 차단되는 것을 확인할 수 있었다. 웨스턴 블럿 분석에서 necX를 전처치한 세포에서 미토콘드리아의 활성 라디칼에 관여하는 phospho-p38 MAPK과 phospho-JNK의 발현이 감소하였으며 초기 재산화 손상에 관여하는 인자로 알려져 있는 HMGB1도 억제되는 것을 입증하였다. 동물실험은 SD 백서의 좌관상동맥 결찰/재관류 모델을 이용하여 진행하였다. 대조군으로 5% 포도당 용액 처리군과 양성 대조군으로 cyclosporine A(CsA), 실험군으로 NecroX를 재관류 5분전 중심정맥을 통해 정주하였다. 심장기능 평가와 좌심실 내경 측정은은 모델 형성 직전과 수술 후 3일, 1주, 2주째 심초음파도로 평가하였고 2주째 동물들을 희생시켰다. 5% 포도당을 전처치한 대조군과 cyclosporin 투약한 양군 모두와 비교시 necX 투약군은 심근괴사를 효과적으로 억제하였고 {NecX=7.8±7.8%: CsA=32.3±5.1%: 대조군=65.4±2.4%(p=0.041 NecX vs. CsA) (p=0.017 NecX vs. 대조군)}, 좌심실 섬유화를 감소시키며{NecX= 4.8±0.9%

CsA=18.8±1.3%

대조군=25.7±1.6%, (p=0.006, NecX vs. CsA) (p=0.011, NecX vs control) 초기 손상시 혈청에서 증가하는 심근효소 수치를 감쇄시켰다. 또한 NecX 투약군에서 좌심실 수축기능은 효과적으로 유지되었으며{14일째 좌심실 구혈율

NecX=57.9±2.4%

CsA=46.7±3.0%

대조군=44.6±1.9%(p=0.012, NecX vs. CsA)(p=0.008, NecX vs. 대조군)} 좌심실의 확장성 재형성을 효과적으로 예방하였다{14일째 수축기말 좌심실 내경

NecX= 4.6± 0.3mm

CsA=5.6±0.3mm

control=6.3±0.2mm, (p=0.075, NecX vs CsA)(p=0.003, NecX vs control)}. 결론: 새로운 세포괴사 억제제인 necroX는 심근 허혈-재관류 손상을 예방하는 효과를 보이며 이로 인해 심근경색 환자의 재관류 치료에 심근보호를 위해 부가적 치료 약제로서의 가능성을 보여 주었다.

Introduction: Reperfusion, although essential for salvage of ischemic myocardium, paradoxically causes a wide variety of injuries. The opening of the mitochondrial permeability pore and Ca2+overload contribute to myocardial I/R injury. In this study, we investigated the protective role of a novel necrosis inhibitor against myocardial ischemia-reperfusion (I/R) injury, using in vitro and in vivo models. Methods: H9C2 cardiomyoblasts and neonatal rat cardiomyocytes were exposed to hypoxia-reoxygenation injury after pretreatment with dimethyl sulfoxide (vehicle), necrosis inhibitor (NecX), antioxidant (vitamin C, E or combination, or N-acetyl cysteine) or apoptosis inhibitor (Z-VAD-fmk). We analyzed the pathways and mechanisms of cell death, mitochondrial membrane potential and mitochondrial Ca2+level. Using Sprague-Dawley rats exposed to myocardial ischemia for 45 minutes followed by reperfusion, we compared the in vivo therapeutic efficacy of NecX and cyclosporine A (CsA) with 5% dextrose (control), each administrated 5 minutes before reperfusion. Results: Protection of cell death from hypoxia-reoxygenation stress was mainly achieved by NecX, inhibitor of necrosis, but not by Z-VAD-fmk, inhibitor of apoptosis (necrotic cells in NecX, 13.5±1.9%

vehicle, 44.1±3.1%

Z-VAD, 40.1±3.6 %, p = 0.049). This powerful cell protection effects of NecX was based on its potent ROS scavenging activity and inhibitory effect on ROS-generating enzyme compared with antioxidant vitamin C or E or combination, or NAC. NecX preserves mitochondrial membrane potential, mitochondrial structure, and prevents Ca2+ influx. Inhibition of necrosis by NecX was accompanied by reduction of phospho-p38 MAPK and phospho-JNK (signals of mitochondrial ROS), and decrease of HMGB1 (an early mediator of I/R injury). In vivo model, Pretreatment with NecX markedly inhibited myocardial necrosis {NecX=7.8±7.8%: CsA=32.3±5.1%: control=65.4±2.4%: (p=0.041 NecX vs CsA) (p=0.017 NecX vs control)}, reduced the fibrotic area {NecX= 4.8±0.9%

control=25.7±1.6%, (p=0.006, NecX vs CsA) (p=0.011, NecX vs control) and attenuated the release of cardiac enzymes. Additionally, NecX preserved systolic function {LVEF at 14thday

control=44.6±1.9%, (p=0.012, NecX vs CsA) (p=0.008, NecX vs control)} and prevented pathologic dilatory remodeling of left ventricle {LVESD at 14thday

NecX=4.6±0.3mm

control= 6.3±0.2mm, (p=0.075, NecX vs CsA) (p=0.003, NecX vs control)}. Conclusion: The novel necrosis inhibitor has a significant protective effect against myocardial I/R injury, indicating that it is a promising candidate for cardioprotective adjunctive therapy with reperfusion in patients with myocardial infarction.