볏짚으로부터 추출된 단당류와 Levulinic acid의 주입방식에 따른 Cupriavidus necator에 의한 바이오플라스틱 원료물질 생산 연구

Abstract

PHA (polyhydroxyalkanoate)는 미생물 체내 에너지 저장물질로 생분해성과 생체적합성이 우수하여 의료용 바이오플라스틱 소재의 원료물질로 이용되고 있다. PHA는 생산 단가가 높아 대량생산에 어려움이 있어 최근에는 농업부산물(예 : 볏짚)을 원료로 하여 자원의 재순환 및 원가 절감을 위한 연구가 진행되고 있다. 하지만 기존에 농업부산물을 이용한 PHA 생산은 P(3HB) (poly-3-hydroxybutyrate) 생산에 집중되어 있으나 결정성이 높아 깨지기 쉬운 단점이 존재한다. 따라서 levulinic acid와 같은 가소성 역할을 하는 물질을 이용하여 P(3HB-co-3HV) (poly-3-hydroxybutyrate-co-3-hydroxyvalerate) 공중합체 형성을 통해 가공성을 향상시킬 수 있다. 따라서 볏짚으로부터 미생물이 PHA 축적할 때 필요한 단당류와 물성개선을 위해 levulinic acid를 추출하여 P(3HB-co-3HV) 생산함으로서 의료용 바이오플라스틱 소재의 생산이 가능할 것이다. 본 연구에서는 Cupriavidus necator 균주를 이용하여 국내에서 가장 많이 발생하는 농업부산물인 볏짚으로부터 의료용 P(3HB-co-3HV) 생산을 위한 볏짚의 전처리(탈 리그닌화) 방법 및 조건을 확보 하였다. 그 후 전처리 후 생산된 볏짚 가수분해물의 미생물에 대한 독성 영향을 확인 후 P(3HB-co-3HV) 생산을 위한 희석배수를 결정하였다. 희석배수 조건 선정후에는 볏짚 가수분해물의 주입방법 선정을 통해 P(3HB-co-3HV)의 생산량 및 3HV mol%를 개선시키는 연구를 수행하였다. 볏짚의 전처리 방법 및 조건을 확보하고자 바이오매스의 일반적인 전처리 방법인 산, 알칼리, 열수를 이용한 볏짚의 전처리 방법을 비교하여 미생물이 PHA 생산에 필요한 단당류 추출량이 가장 많은 방법을 선정하였다. 실험 결과 황산을 이용시 0.293 g/g(g 단당류/g 볏짚)으로 열수 (0.05 g/g), 알칼리(0.003 g/g)보다 단당류 추출량이 높아서 산을 이용한 전처리 방법을 선정하였다. 황산 농도(0.5%, 1%, 2%, 4%, 6%), 가열시간 (15, 30, 60분), 고액비(1:5, 1:10, 1:20)에 대해 볏짚으로부터 단당류 추출량을 비교하여 산 처리 조건을 선정하는 실험을 진행하였다. 볏짚의 산을 이용한 전처리 결과 황산 농도 0.5%에서 2% 까지는 시간이 증가함에 따라 단당류 추출량이 증가하였으나 2% 이후에는 황산 농도, 처리 시간에 영향을 받지 않았으며 고액비 또한 단당류 추출에 큰 영향을 미치지 않았다. 황산 농도 2%, 처리시간 60분, 고액비 1:10 조건에서 0.332 g/g으로 단당류 추출량이 가장 높아서 볏짚의 산 처리 조건으로 선정하였다. 미생물에 의한 P(3HB-co-3HV) 축적을 위해 볏짚 가수분해물 내의 levulinic acid 추출 조건을 선정하고자 볏짚 전처리 후 생성된 가수분해물의 추가 열처리 시간(20, 40, 60분)에 따른 가수분해물 내 levulinic acid 추출된 농도를 비교하였다. 실험 결과 가수분해물의 추가 열처리 시간이 증가함에 따라 levulinic acid 농도가 증가하였고 S/LA비(단당류와 Levulinic acid의 비)가 levulnic acid 증가에 따라 감소하였다. 문헌조사 결과 의료용 바이오플라스틱 소재 생산을 위한 P(3HB-co-3HV)의 3HV mol%가 20%-30% 내의 범위이며 이때 S/LA비가 20:1-40:1 이어야 한다. 본 실험 결과 60분 추가 열처리 시 S/LA비가 30.33:1이었으므로 levulinic acid 추출 단계에서는 60분 추가 열처리 조건을 선정하였다. 볏짚 전처리 조건을 선정 후 볏짚 가수분해물의 미생물 독성 영향을 확인하고자 H/M비(hydrolysate to mineral medium ratio), 즉 가수분해물 희석배수 실험을 1:99, 1:19, 1:9, 2:8, 3:7, 4:6, 5:5, 7:3, 9:1의 조건에 대해 C.necator 균주의 개체수가 영향을 받지 않는 조건을 찾고자 진행하였다. 실험 결과 7:3, 9:1 조건에서는 미생물이 각각 48시간, 24시간 이후에 검출되지 않았으며 1:99, 1:19, 5:5 조건에서는 개체수가 영향을 받는 것을 확인할 수 있었다. 반면 1:9, 2:8, 3:7, 4:6 조건에서는 미생물 개체수가 영향을 받지 않았다. 따라서 미생물 개체수가 영향을 받지 않은 H/M비 (1:9 ? 4:6) 조건에 대해 P(3HB-co-3HV) 축적 실험을 진행하였다. PHA 축적 실험 결과 H/M비 2:8에서 P/L/h (produced 3HV per levulinic acid per hour) 값이 0.108 g/g/h로 가장 높아 levulinic acid를 효율적으로 이용하였으며 생산된 P(3HB-co-3HV)의 농도와 3HV mol% 또한 각각 배양 후 12시간에 0.979 g/L, 19.66%로 H/M비 3:7(접종 후 24시간에 1.091 g/L, 20.88%), 4:6(접종 후 48시간에 1.054 g/L, 21.62%) 조건과 큰 차이가 없었다. 가수분해물 희석배수 조건을 2:8 조건으로 선정 후 같은 양의 가수분해물의 주입방법을 다양하게 분할하여(12번, 8번, 4번, 2번 분할주입, 단일 펄스주입) 주입함으로서 P(3HB-co-3HV) 생산량을 증가시키는 실험을 진행하였다. 실험결과 볏짚 가수분해물을 4번 분할 주입시 배양 후 12시간에 P(3HB-co-3HV)을 1.736 g/L 생산하여 농도가 가장 높았으나 3HV mol%가 11.1%로 가장 낮았다. 반면 단일 펄스주입 조건에서는 0.979 g/L의 P(3HB-co-3HV)를 생산하여 생산성이 가장 낮았으나 3HV mol%가 18.0%로 분할 주입 조건들 중 가장 높은 값을 기록하였다. 따라서 의료용 바이오소재로 응용을 위한 P(3HB-co-3HV)의 3HV mol%가 20%-30%임을 감안 할 때 3HV mol%증가를 위해 단일 펄스주입 조건에 대해 가수분해물의 주입 방법을 levulinic acid가 고갈되는 시점에 가수분해물을 반복하여 주입하는 추가반복 주입 실험을 진행하였다. 볏짚 가수분해물 추가 반복주입 실험 결과, 12시간마다 주입 시 P(3HB-co-3HV)의 농도가 증가하는 것을 확인할 수 있었으며 배양 후 108시간에 3.9 g/L 생산하였다. 생산되는 P(3HB-co-3HV)의 3HV mol%는 볏짚 가수분해물을 지속적으로 주입할 때마다 증가하는 것을 확인하였으며 84시간에는 3HV mol%가 30%까지 증가하다가 그 이후에는 증가가 발생하지 않았다. 따라서 볏짚 가수분해물의 추가 반복주입을 통해 생산되는 P(3HB-co-3HV)의 3HV mol%를 20%-30% 범위 내로 생산이 가능하다는 것을 확인할 수 있었다. 본 연구를 통해 국내에서 가장 많이 발생하는 농업부산물인 볏짚을 원료로 하여 고부가가치 산물인 의료용 생분해성 바이오플라스틱 소재의 원료물질인 P(3HB-co-3HV)의 생산 가능성을 확인 하였다. 본 연구는 원료물질을 볏짚을 이용함과 동시에 정제된 levulnic acid의 추가 사용 없이 20%-30% 범위의 3HV mol%를 지닌 P(3HB-co-3HV) 생산을 통해 PHA 생산 단가 절감 효과를 가져다 줄 것이다. 또한 생산 단가 절감에 따른 대량생산을 통해 석유계 플라스틱 사용에 따른 환경 문제를 PHA 소재로 대체함으로서 환경문제(폐플라스틱 처리문제, 석유 사용에 따른 부산물 발생문제) 등을 해결할 수 있을 것으로 판단한다.