Study on electrochemistry at artificial synapse between surface modified electrode and neuron

Abstract

최근 전세계적으로 뇌와 신경계에 대한 사회적인 관심 증가와 함께 브레인-컴퓨터 인터페이스 (brain-computer interface, BCI)와 뇌역공학 (reverse engineering the brain)과 같은 신경 인터페이스 분야의 연구가 활발히 이루어지고 있다. 신경 인터페이스는 생체 내 신경계와 외부 바깥 세상을 기기 장치로 연결하여 신경 정보를 얻거나 신경 네트워크를 이해하는데 주된 목적을 두고 있다. 대부분의 신경 인터페이스 기술은 신경계 조직 혹은 세포 근처에 신경 전극 (neural electrodes)을 단순히 위치시킴으로써 전극과 신경계와의 매우 수동적이고 물리적인 접촉에만 의존하고 있다. 실제 신경생물학적 체계에서 신경세포들은 시냅스라는 세포 접합 부위를 통해 전기적인 신호인 활성전위 (action potentials, APs)와 화학적인 신호인 신경전달물질 (neurotransmitters)의 형태로 신경 정보를 전달함으로써 서로 긴밀한 의사소통을 한다. 신경정보전달 조절의 중요한 역할을 하는 시냅스는 신호를 전달하는 흥분성 시냅스 (excitatory synapse)와 신호 전달을 저지하는 억제성 시냅스 (inhibitory synapse)로 구분된다. 이런 시냅스의 특이성을 결정하는 데에는 신경접착분자 (synaptic cell adhesion molecules, synaptic CAMs) 단백질들이 중요한 핵심 요인이며, 이들은 시냅스를 이루고 있는 두 신경세포의 세포막에 위치하여 서로 쌍을 이루어 접합함으로써 매우 좁은 약 20 nm의 시냅스 틈새 (synaptic cleft)를 유지한다. 이와 같은 시냅스 시스템에 초점을 두어, 본 학위논문에서는 전극과 신경세포 사이에 인공시냅스 인터페이스를 구축함으로써 인공시냅스로 연결하는 새로운 신경 인터페이스의 플랫폼을 제안한다. 인공시냅스를 통해 시냅스 기반 신경정보를 검출함으로써 신경세포와의 양방향 의사소통이 가능할 것이며, 인공시냅스에 의해 형성된 매우 좁은 나노 틈새 (synaptic cleft)에서의 신경신호 거동에 대한 새로운 전기화학적 연구를 수행할 수 있을 것이라 기대한다. 시냅스 특이성과 견고성을 가진 인공시냅스 인터페이스를 구축하기 위하여, 전극의 표면 개질화에 조작된 신경접착단백질을 도입하는 일련의 연구들을 수행하였다.

먼저, 조작한 시냅스후 접착단백질 (postsynaptic CAMs)을 마이크로비드에 기능화한 인공수상돌기 (artificial dendrites)에 의해 견고하게 시냅스 특이성을 갖는 인공시냅스가 유도됨을 확인하였다. 흥분성과 억제성의 시냅스 특이성은 신경 네트워크 안에서 화학적인 신경전달물질을 통한 신경정보 처리를 조절하는 기능을 한다. 시냅스 기반 신경 인터페이스에 기초를 두기 위해, 특이성-시냅스생성 단백질 엑토도메인 (ectodomain)의 C-말단에 형광단백질 (red fluorescent protein, RFP)과 바이오틴 (biotin)이 표지되도록 조작하였고, 이를 인공물인 마이크로비드에 기능화 해줌으로써 인공수상돌기를 준비하였다. 흥분성 인공시냅스는 조작한 neuroligin 1 (NL1-R)에 의해 유도 가능했고, 신경세포와 함께 배양함으로써 세포분화단계에 상관없이 세포에 흥분성 시냅스전 분화를 형성시켰다. 억제성 인공시냅스는 neuroligin 2 (NL2-R)와 slitrk3 (SL3-R)에 의해 유도 가능했으며, 성체 신경세포와 함께 배양해줌으로써 신경세포에 억제성 시냅스전 분화를 생성시켰다. 마이크로유체 배양 챔버 (microfluidic culture chamber) 시스템을 이용하여 신경세포의 축색돌기 (axons)를 세포체 소마 (somata)와 수상돌기 (dendrites)로부터 분리하여 배양한 뒤, 인공수상돌기인 시냅스후 접착단백질 마이크로비드와 신경세포의 축색돌기와 접촉함으로써 인공시냅스가 단백질에 따라 시냅스 특이성을 유지한 채 견고하게 유도되었다. 또한 형성된 인공시냅스에서, 특히 NL1-R에 의한 흥분성 인공시냅스에서 신경전달물질인 글루타메이트 (glutamate)가 세포 자극에 의해 방출되는 것을 검출함으로써 유도한 인공시냅스가 활성을 지닌 시냅스임을 확인하였다. 견고하게 시냅스 특이성을 유지하면서 활성을 갖는 인공시냅스는 시냅스 기반 인터페이스 구축으로의 가능성을 보여줬다.

둘째, 상용화된 마이크로전극 어레이 (microelectrode array, MEA)를 이용하여 전극에 금을 전기화학적으로 도금하고 조작한 시냅스후 접착단백질 NL1-R을 고정해줌으로써 전극과 접촉한 신경세포에 인공시냅스를 유도하였다. 다중 전압 펄스 방법 (multi-potential pulse technique)을 이용하여 전극 위에 금을 전기화학적으로 도금함으로써 전극 표면에 균일하게 금이 도금되었고 거칠기 (roughness)를 가진 구조를 함으로써 전극 실제 표면적이 증가하였고 낮은 전극 계면 저항을 나타냈다. 금을 도금함으로써 일반적으로 사용되는 폴리라이신 폴리머를 코팅한 마이크로전극 (poly-D-lysine, PDK coated MEA) 보다 향상된 전극의 전기화학적 활성을 보여주었고, 또한 금이 생체친화성 금속이면서 표면 기능화가 쉬운 금속이라는 이점을 활용할 수 있었다. 전극에 금을 도금한 후에 바이오틴이 표지된 싸이올 (thiol) 분자를 이용하여 자가조립단층 (self-assembled monolayer, SAM)을 형성하였고, 스트렙타비딘 (streptavidin, SAV)을 고정한 뒤 조작한 시냅스후 접착단백질 NL1-R을 최종적으로 고정하였다. 이와 같은 표면 개질화 과정을 통해 시냅스후 전극을 준비하였고, 시냅스후 전극은 충분히 신경신호를 검출하거나 시냅스 틈새 전기화학 연구를 수행할 만큼 전기화학적으로 활성을 가진 전극임을 확인하였다. 게다가 신경세포를 전극 위에 배양함으로써 전극과 접촉한 세포에 흥분성 인공시냅스가 유도됨을 확인하였다. 따라서 인공물인 전극 위에 인공시냅스를 형성할 수 있는 전극을 제작하였고, 인공시냅스 기반 인터페이스를 구축할 수 있음을 확인하였다. 앞으로 인공시냅스 인터페이스를 통한 신경신호 검출 및 신경정보전달의 거동에 대한 새로운 전기화학적 연구가 가능할 것이다.

Recently, neural interfaces such as a brain-computer interface (BCI) and reverse-engineering the brain have been actively developed along with the increasing social concerns to the brain and nerve system. The main objective of neural interface technology is to establish connections between the outside world and the nervous system, to acquire neural information or to understand neural networks. Most of neural interface techniques depend only on the physical and passive contacts simply placing the neural electrodes near the nervous system. In the real neurobiological system, neuronal cells communicate via a chemical synapse, which is active spot where transmission of neural information in the form of action potentials (APs) and neurotransmitters occurs. Specificity of excitatory or inhibitory for the synaptic transmissions is determined by various trans-synaptic cell adhesion molecules (CAMs) that are intensively located on the membrane of neurons in the synaptic clefts. With a focus on these system of the chemical synapses, this dissertation suggests an artificial synaptic interface closely connected between electronic electrodes and neurons. Through this, it is expected that it will be able to bilaterally communicate with the synaptic-based neural information and investigate an electrochemical behavior in the artificial synapses. For construction of the artificial synaptic interface having type-specificity and durability, a series of studies were accomplished by the introduction of the engineered synaptic CAMs to the surface modification of the electrodes.

First, the robust type-specific artificial synapses were induced by artificial dendrites, which were functionalized microbeads with the engineered postsynaptic CAMs. Type-specificity of synapses, excitatory and inhibitory, regulates information process in neural networks via chemical neurotransmitters. To lay a foundation of synapse-based neural interfaces, artificial dendrites were generated by functionalizing abiotic substrata microbeads with ectodomains of type-specific synaptogenic proteins that were C-terminally tagged with biotinylated fluorescent proteins. The excitatory artificial synapses displaying engineered ectodomains of postsynaptic neuroligin 1 (NL1-R) induced the formation of excitatory presynapses with mixed culture of neurons in various developmental stages, while the inhibitory artificial dendrites displaying engineered neuroligin 2 (NL2-R) and Slitrk3 (SL3-R) induced inhibitory presynapses only with mature neurons. By contrast, if the artificial dendrites are applied to the axonal components of micropatterned neurons, correctly-matched synaptic specificity emerges regardless of the neuronal developmental stages. The hemisynapses retained their initially established type-specificity during neuronal development and maintained their synaptic strength provided live neurons, implying the possibility of durable synapse-based biointerfaces.

Second, the artificial synapses were induced by the microelectrodes modified by electrochemically plating of gold on a commercially available MEA and immobilizing the engineered postsynaptic CAM neuroligin 1 (NL1-R). The gold electrodeplated by multi-potential pulse technique had a uniform roughness and the improved electrochemical activitiy with large surface area and low electrode impedance much more than a poly-D-lysine (PDK) coated electrode in the MEA generally used in the neuroscience field

the electrochemial depostion of Au . Because the gold electrode surface can be also easily functionalized with biomolecules, immobilization of the biotinylated NL1-R on the electrode was facilitated after the surface modification process with biotin tagged self-assembled monolayer (SAM) reagents and streptavidins. The artificial synaptic interfaces induced on the hybrid postsynaptic microelectrodes durably maintained the type-specificity of the excitatory glutamergic by NL1-R. In addition, the postsynaptic microelectrodes would have an electrochemical activity sufficiently to in situ record a neural information or identify electrochemical behaviors in synaptic cleft between the electrode and the presynaptic neurons.