Production of ethanol from xylose using xylose

Abstract

바이오에탄올은 친환경적이고, 현재 운송 수단에 바로 이용 가능하여 경제성, 효율성이 우수하므로 화석 연료의 대체에너지로서 주목 받고 있다. Xylose는 목질계에서 포도당에 이어서 2번째로 풍부한 발효 가능한 탄소원이다. 바이오매스로부터 에탄올을 경제적으로 생산하기 위해서는 효율적으로 xylose를 발효할 수 있는 재조합 균주 개발이 반드시 필요하다. Saccharomyces cerevisiae는 산업적으로 에탄올 생산 균주로 사용되지만, xylose를 탄소원으로 이용하지 못한다. 이는 xylose를 xylulose로 전환하는 대사활성이 없기 때문이다. 효모에서, xylose는 2종류의 산화환원효소인, NAD(P)H의존적 XR과 NAD+ 의존적인 XDH에 의해서 xylulose로 전환이 된다. 마지막으로 XK에 의해 xylulose는 xylulose-5-phosphate로 전환이 되며 이것은 5탄당 인산회로에 의해서 이후의 대사가 진행된다. 이 연구는 xylose 대사경로를 자체적으로 갖고 있는 균주 중 Kluyveromyces marxianus를 선택하여 관련 유전자들을 얻고, 이들을 S. cerevisiae에 도입하여 xylose에서 에탄올을 생산하고자 하였다.필요한 유전자는 XR을 암호화하는 XYL1, XDH를 암호화하는 XYL2, XK를 암호화하는 XYL3이다. 먼저, S. cerevisiae 내에서 XYL1, XYL2, XYL3 각각의 유전자 발현 여부를 확인하였다. KmXYL1이 도입된 DX23/KM1에서 KmXYL1의 specific activity는 0.48 U/mg이었고, xylose 발효에서 10.5 g/L ethanol을 생산하면서 KmXYL1의 발현을 확인할 수 있었다. KmXYL2를, 발현이 검증된 KmXYL1과 함께 도입한 ISXK/KM12에서 KmXYL2의 specific activity는 0.21 U/mg, 9.26 g/L ethanol을 생산했다. KmXYL3 역시 발현이 확인된 KMXYL1, 2과 함께 도입하여 KM123을 구축했고 KmXYL3의 specific activity는 4.6 U/mg, 11.1 g/L ethanol 생성함으로서, S. cerevisiae 내에서 KmXYL1, 2, 3 유전자가 모두 발현됨을 확인하였다. 따라서, K. marxianus의 xylose 대사 경로를 이용해 xylose로부터 에탄올을 생산하는 균주를 성공적으로 구축했다.이 균주를 현재 많이 이용되는 Scheffersomyces stipitis 유래의XYL1,2,3와 비교해 보았다. K. marxianus는 NADPH 의존적 XR과 NAD+ 의존적 XDH 사이에 조효소가 불균형을 이룰 가능성이 높은데, NADPH와 NADH 모두 의존적인 Sch. stipitis 유래의 XR과 비교했을 때 xylose 발효에 미치는 영향을 보고자 하였다. specific activity는 XR, XDH, XK 모두 Sch. stipitis 유전자들이 더 높았지만, 40 g/L xylose 발효에서 KM123이 약 10.1 g/L의 에탄올을 생성해 Ss123과 유사했고 Ethanol yield는 0.33 ethanol g/xylose g, productivity는 0.14 g/L․h로 역시 유사했다. 조효소의 불균형이 있지만 유전자들 간의 조화가 에탄올 생성에 미치는 영향도 매우 중요하다고 사료된다.Km12,3에서 에탄올 생산을 증가시키고자 초산을 생성하는 ALD6 유전자를 파쇄하였다. (KM12,3::∆ALD6) 이를 미세호기조건에서 발효한 결과 KM12,3::∆ALD6가 세포 성장이 좋고 acetate 축적이 눈에 띄게 줄어들었지만, xylose의 소비와 ethanol 생성에는 크게 영향을 미치지 않았다. 이는 KM123 균주 자체로 xylose 소비가 좋았고, ALD6 유전자를 파쇄로 NADPH의 생성이 저해되어 XR의 기능에 도움을 주지 못했을 것으로 생각된다. 본 연구에서는 K. marxianus 유전자를 이용해 xylose에서 에탄올을 생성하였으며, 표면적인 조효소의 불균형이 있더라도 에탄올을 생성할 수 있음을 분명하게 보여주었고 이는 유전자들 간의 조화가 다른 중요한 요소이기 때문으로 사료된다.

Xylose is a major fermentable sugar present in lignocellulosic biomass, the second most abundant carbohydrate in nature to glucose. Efficient xylose fermenting strains are required to develop economically viable processes to produce biofuels such as ethanol from biomass. Although Saccharomyces scerevisiae has been used for industrial ethanol production, native S.cerevisiae cannot utilize xylose as a carbon source because the bakers yeast does not contain the metabolic activity to convert xylose to xylulose. In yeasts, xylose is converted to xylulose by two oxidoreductases, NAD(P)H-linked xylose reductase (XR

EC1.1.1.21) and NAD+ xylitol dehydrogenase (XDH

EC1.1.1.9), and finally, xylulokinase (XK

EC2.7.1.17) phosphorylates xylulose into xylulose5-phosphate, which is metabolized further via the pentose phosphate pathway. This study was carried out to clone the xylose metabolic genes from Kluyveromyces marxianus and to compare the xylose metabolic activity to ethanol between K. marxianus and Scheffersomyces stipitis. K. marxianus is thermotolerant and could produce ethanol from xylose naturally. The full genome sequences of K. marxianus were completed recently. The three key genes involved in the xylose metabolism were cloned from K. marxianus such as XYL1 for XR, XYL2 for XDH and XYL3 for XK. These genes were introduced to S. cerevisiae D452-2 used as host. The engineered S. cerevisiae strain (DX123/KM1) containing the K.marxianus XR gene along with the Sch. stipitis XDH and XK genes was able to produce 10.5 g/L ethanol from xylose along with specific activity of XR of 0.48 U/mg. Similarly, the genes for XDH and XK from K. marxianus were functionally expressed in S. cerevisiae and the engineered S. cerevisiae strains can convert xylose to ethanol successfully. All three xylose metabolic genes from K. marxianus were introduced to S. cerevisiae and the xylose metabolic activity was evaluated in terms of ethanol yield and ethanol productivity. Specific activitiesof XR, XDH and XK from Sch. stipitis were all higher than the corresponding enzymes from K. marxianus. The recombinant S. cerevisiae strain containing the K. marxianus xylose metabolic genes (KM123) produced 10.1 g/L ethanol, 0.33 g ethanol/ g xylose ethanol yield and 0.14 g/L.h ethanol productivity. While the S. cerevisiae strain transformed with the Sch. stipitis (SS123) produced 10.2 g/L ethanol, 0.35 g ethanol/ g xylose ethanol yield and 0.14 g/L.h ethanol productivity. In order to improve an ethanol fermentation performance by reducing acetate formation, the ALD6 gene which can convert acetaldehyde to acetate was disrupted to construct the S. cereivisae strain (KM123::∆ALD6). The strain produced 0.2 g/L acetate compared with 2.8 g/L in the control strain. Interestingly, the consumption of xylose and production of ethanol were not affected by disruption of ALD6 This thesis showed production of ethanol from xylose by the recombinant S. cerevisiae containing the three genes (XR, XDH and XK) from K. marxianus. The ethanol performance of the S.cerevisiaeKM123 was comparable to the S. cerevisiae strain transformed with the Sch. stipitis XR and XDH and S. cerevisiae XK.