Construction of infectious full-length clones of Cucumber green mottle mosaic virus and Zucchini yellow mosaic virus isolated from cucurbitaceous crops in Korea and their application as viral vectors

Abstract

박과작물은 Cucurbitaceae에 속하고 전 세계적으로 118속 825종이 분포하고 있으며, 국내에서는 주로 수박, 참외, 오이, 호박 등이 재배되고 있다. 박과작물은 현재 국내에서 주요 작물 중 하나로, 현재 농업현장에서 박과작물에 감염되는 바이러스는 경제적으로 심각한 문제가 되고 있는 것으로 보여진다. 박과작물에 피해를 입히는 바이러스 중 Cucumber green mottle mosaic virus(CGMMV)와 Zucchini yellow mosaic virus(ZYMV)를 이용하여 실험을 진행하였다. Tobamovirus속에 속하는 CGMMV는 약 300nm의 간상형 구조이며 6.4 kb의 게놈을 가지고 있다. Potyvirus속에 속하는 ZYMV는 약 750nm의 사상형 구조로 9.5 kb의 게놈을 가지며, 두 바이러스는 양성 외가닥 RNA로 이루어져 있다. 본 연구에서는 우리나라의 기주와 각 지역에 따라 분리 동정된 분리주를 이용하였다. 먼저 2003년도 선행 연구에 따르면 CGMMV는 기주가 따라, 우리나라의 watermelon(KW)과 oriental melon(KOM)에서 분리동정 되었다. ZYMV는 2005년도 선행 연구에 따르면 우리나라의 지역에 따라 Pumpkin-Andong(PA), -Euiryoung(PE) 그리고 -Suwon(PS)에서 분리동정 되었다. CGMMV의 두 개의 분리주(KW와 KOM)들과 ZYMV의 세 개의 분리주 중 PA을 이용하여 실험을 진행하였다. CGMMV와 ZYMV 같이 RNA 바이러스는 염기서열의 변이가 심하기 때문에 유전적 다양성이 존재할 수 있으므로 RNA보다 안정적인 DNA로 합성하여 클론으로 유지해야 한다. 따라서 CGMMV의 분리주들 (KW와 KOM)와 ZYMV PA 분리주는 감염성 클론(pCGMMV-KW, pCGMMV-KOM와 pZYMV-PA)을 제작하였고 식물체 내에서 병원성을 확인하였다. CGMMV의 분리주(KW와 KOM)들은 붉은 명아주에서 KW 분리주만이 국부 황백화 병징을 일으킨다고 보고 되었으나, 현재 실험에서 KW 분리주뿐만 아니라 KOM 분리주도 국부 황백화 반점을 일으키는 것으로 확인되었다. 클론의 염기서열을 분석하여 기존 보고된 염기서열과 비교해보았으나 붉은 명아주에서 병징 변화를 일으킬만한 아미노산을 확인할 수 없었다. CGMMV와 ZYMV 감염성 클론은 박과작물에 사용 가능한 바이러스 벡터로서 개발하였다. 먼저 CGMMV의 경우, Agrobacterium을 이용한 접종방법으로 N. benthamiana에서 확인할 수 있었다. ZYMV-PA 감염성 클론은 기계적인 접종에 의해 쉽게 박과작물에 접종 가능한 장점을 가지고 있기 때문에 박과작물에서 전반적으로 외래 유전자 발현을 시킬 수 있는 바이러스 벡터로 개발하였다. 먼저 바이러스의 특정 부위에 특정 유전자가 삽입될 수 있도록 멀티 클로닝 사이트 (MCS)를 삽입하였고, 바이러스 자체의 protease 역할을 하는 단백질에 의해 절단되어 외래유전자가 발현되도록 제작하였다(pZYMV-MCS). pZYMV-MCS에 삽입되는 단백질이 식물체 내에서 잘 발현되는지 확인하기 위해 리포터 유전자로 녹색 형광 단백질 유전자(gfp)와 제초제 저항성 유전자(bar)를 이용하였다. 이 유전자들은 MCS의 엔자임 사이트를 이용하여 pZYMV-MCS에 삽입되었다(pZYMV-GFP와 pZYMV-Bar). pZYMV-GFP을 접종한 쥬키니 호박에서 GFP 단백질이 전반적으로 발현되는 것을 확인하였다. 제초제를 처리했을 때, 아무것도 감염되지 않는 대조 식물이나 Bar 유전자가 삽입되지 않은 pZYMV-PA에 감염된 식물은 고사되었지만 pZYMV-Bar을 접종한 식물은 제초제가 처리된 잎뿐만 아니라 상엽이 고사되지 않고 자라는 것을 확인하였다. ZYMV 기반 바이러스 벡터의 효율성은 상엽에서 RT-PCR을 이용하여 GFP나 bar 유전자를 포함하는 부분을 검출함으로써 확인하였다. 세대진전실험을 통해 ZYMV 기반 바이러스 벡터는 삽입된 유용 유전자들을 안정적으로 발현할 수 있다는 것이 확인할 수 있었다.

Cucumber green mottle mosaic virus (CGMMV) and Zucchini yellow mosaic virus (ZYMV) infect many cucurbitaceous crops causing significant economic damages in many fields. The CGMMV, which belongs to the genus Tobamovirus, is a rod-shaped virus with approximately 300 nm in length and contains a plus-sense single strand RNA (ssRNA) genome of 6.4 kb. The ZYMV, which belongs to the genus Potyvirus, is a flexuous rod-shaped virus of about 750 nm in length and contains a plus-sense ssRNA of 9.5 kb. In this study, two CGMMV isolates called CGMMV-KW and -KOM, which are isolated from watermelon and oriental melon, respectively and one ZYMV isolate called ZYMV-PA, which is obtained from pumpkins in Andong, were used to construct full-length infectious clones. RT-PCR products were cloned into binary vector under the control of the Cauliflower mosaic virus 35S promoter and NOS terminator and were designated as pCGMMV-KW, pCGMMV-KOM, and pZYMV-PA, respectively. For infectivity test of full-length clones, the pCGMMV-KW and pCGMMV-KOM, which were transformed into Agrobacterium tumefaciens, were infiltrated into Nicotiana benthamiana by agroinfiltration methods. The two pCGMMVs caused systemic mosaic symptom on N. benthamiana. Interestingly, the two pCGMMVs caused local chlorotic spot symptom on Chenopodium amaranticolor when saps of N. benethamiana infected with these two pCGMMVs were used as inoculums. Since it has been reported that CGMMV-KOM isolate do not infect C. amaranticolor, I sequenced the two pCGMMV isolates and compared them with previously reported the CGMMV genome sequences. The difference in sequences between the pCGMMV-KOM and the reported CGMMV-KOM had no relationship with the symptom development on C. amaranticolor. Further work is required to identify the factors that are related to the symptom development. When pZYMV-PA was inoculated onto Cucurbita pepo L. var. zucchini by mechanical methods, same symptoms were observed as that in the previous report. Compared with the previously reported ZYMV-PA genome sequences, the sequence of pZYMV-PA revealed difference of eight amino acids. The pZYMV-PA was engineered as a viral vector, because it shows systemic symptom in cucurbitaceous crops. The ZYMV-based viral vector enables the systemic expression of foreign proteins in cucurbitaceous crops. This ZYMV-based viral vector was useful in expressing two reporter genes, gfp and bar, in cucurbitaceous crops indicating that pZYMV-based viral vector can be applied for expression of specific foreign genes in cucurbitaceous plants.