Process optimization for production of soluble recombinant PED antigen

Abstract

PED(돼지유행성설사병)은 전염성이 매우 강하며 국내뿐만 아니라 전 세계적으로 돼지농장에 상당한 경제적인 피해를 주는 질병이다. 본 연구의 목표는 E. coli 발현 시스템을 이용하여 가장 적은 비용으로 가장 많은 양의 PED 백신을 생산하는 것으로써 가장 경제적인 PED 대량생산공정 시스템을 구축하는 것이다. 먼저 작은 규모의 플라스크 수준에서 기본적인 조건을 잡고 그 조건을 기반으로 규모를 확대하여 고농도의 세포를 얻기 위해 큰 규모의 발효기에서 대량생산공정 시스템을 구축한 후 정제 조건을 확립하였다. 제 1장에서는 플라스크 수준에서 E. coli 발현 시스템으로 생산된 단백질이 불용성 단백질로 생산되는 문제점을 겪게 되었는데 이것을 극복하기 위하여 chaperone 동시 발현 전략을 도입하였다. 가장 먼저 다양한 chaperone 동시 발현시스템을 검정하여 pTf16 chaperone 시스템이 가장 효과적인 것을 확인하였고, western blot 실험에서 anti-GST 항체를 이용하여 생산된 단백질이 목적 단백질임을 확인 하였다. 그 다음으로 chaperone 유도체인 L-arabinose의 유무를 달리함으로써 chaperone 동시 발현이 목적 단백질인 rGST-COE의 수용성 발현에 효과적임을 확인하였다. 단백질 발현 온도를 15, 21, 28, 37℃로 조절한 결과 15℃에서 가장 높은 수용성 단백질 생산량을 획득할 수 있었다. 발현 온도가 낮아질수록 전사, 번역과 세포 분열 속도가 느려짐으로써 수용성 형태의 생산량이 늘어난다는 것을 검정하였다. 또한 IPTG 농도를 0.1, 0.4, 0.7, 1.0 mM에서 스크리닝하여 0.1 mM IPTG에서 가장 높은 단백질 생산량을 얻었으며, 낮은 유도인자의 농도가 단백질 합성 속도를 늦추고 수용성 형태의 생산량을 증가시킨다는 것을 확인하였다. 발현 유도 시기의 흡광도(OD600)를 0.6, 09, 1.2, 1.5에서 스크리닝함으로써 흡광도 0.6일 때 단백질을 합성하기에 가장 건강하고 대사적으로 활발한 상태라는 것을 확인 할 수 있었다. 발현 유도로부터 12, 24, 36, 48 시간 후로 회수 시간을 조절하였을 때 rGST-COE의 경우 24 시간 이후, rGST-S1D의 경우 12 시간 이후에 가장 높은 단백질량을 얻을 수 있었다. 최종적으로 플라스크 수준에서의 최적화 조건은 pTf16 chaperone 동시 발현, 발현온도 15℃, 0.1 mM IPTG, 유도 시기 흡광도 0.6, 회수 시간은 24시간 (rGST-COE), 12 시간(rGST-S1D)으로 확립하였다. 제 2장에서는 플라스크 수준에서 확립한 조건 중 pTf16 chaperone 동시 발현, 발현 온도 15℃, 0.1 mM IPTG을 기반으로 하여, 단백질 대량 생산을 위한 발효기 수준에서 유도 시기, 성장 온도, L-arabinose 농도의 최적화 조건을 확립 후 정제 조건을 확립하였다. 먼저 발효기 수준에서 초기 지수증식기 흡광도 3∼4 와 중간 지수증식기 흡광도 7∼8에서 유도시기를 조절한 결과, 초기 지수증식기 흡광도 3∼4에서 유도 하였을 때 가장 높은 생산량을 얻을 수 있었다. 그 다음으로는 성장온도를 30, 37℃에서 스크리닝한 결과 30℃에서 가장 높은 생산량을 얻을 수 있음을 확인하였다. 마지막으로 L-arabinose 농도를 0.5, 1.0, 1.5 mg/ml에서 스크리닝하여 0.5 mg/ml에서 가장 높은 생산량을 얻을 수 있었다. 최종적으로 발효기에서의 최적화 조건은 유도시기 흡광도 3∼4, 성장온도 30℃, 0.5 mg/ml L-arabinose로 확립하였다. 마지막으로 최적화 조건으로 생산된 백신을 GSTrap 컬럼을 이용하여 정제조건을 확립하였다. 플라스크에서는 5 mg/ml 정제된 단백질을 얻었고 발효기에서는 53.8 mg/ml 정제된 단백질을 얻음으로써 대략 10배 이상의 수득률을 얻었다. 또한 전자분무이온화 실험을 통하여 감지된 단백질 서열이 rGST-COE와 일치함을 확인함으로써 정제된 단백질이 목적 단백질임을 확인할 수 있었다. 이러한 결과들을 종합적으로 정리해 보았을 때 플라스크 수준에서 다양한 인자들을 경제적이고 간편하게 스크리닝한 후 이를 기반으로 발효기 수준에서의 최적화를 함으로써 플라스크 수준에서 보다 발효기에서 대략 10배 이상의 수득률을 얻을 수 있었다. 본 연구를 통해최적화된 단백질 항원 생산 공정은 향 후 대규모 현장실증 시험이나 임상적 목적을 위한 PED 항원 단백질의 효율적인 대량생산에 크게 기여할 것으로 기대된다.