Thermodynamic characterization of domain motions coupled with ligand binding of Enzyme I in the bacterial phosphotransferase system

Abstract

Enzyme I (EI)이 포함된 당 인산화 시스템은 phosphoenolpyruvate (PEP)를 사용하여 자동 인산화를 할 수 있고 특히 EI은 인산기를 Hpr 이라는 인산기 전달 단백질에 수송한다. 이미 알려진 바로써 많은 단백질 안에서의 도메인 간의 운동은 중요한 역할을 담당하고 있다. EI은 연속된 당 인산화 전달 반응에 관여하는 첫 번째 단백질로서, N-말단 및 C-말단 도메인이 linker helix로 연결되어져 있다. N-말단도메인은 인산화 활성 부위를 가진 EINαβ 도메인과 HPr과 결합하는 EINα 도메인으로 구성되어 있고, C-말단 도메인은 PEP 결합 부위를 가진다. 본 연구에서는 isothermal titration calorimetry를 사용하여 리간드와 결합 및 도메인 사이 상호작용에 대한 열역학적 특성에 대한 분석을 하였고, 이를 위하여 각 도메인들을 선택적으로 제거시킨 EI을 사용하여 관측하였다. 이를 통해 hinge 운동의 Gibbs free energy 값을 측정하였고 (△G = 1.5 kcal/mol), 이 에너지 측면에서 불리한 free energy가 더 유리한 swivel 운동에 의해 극복되어질 것이라고 예상하였다. 또한 hinge 운동들은 EINα 도메인과 EINαβ 도메인 사이의 결합을 약하게 하여 에너지 면에서 불리하며 이는 결합 엔트로피에서 오는 것을 밝혔다. 마지막으로, EI의 리간드인 PEP의 결합과 다음 인산기 전달 단백질인 HPr 결합은 각각의 결합 반응에 있어서 서로 방해를 하지 않는다. 즉, 이 두 개의 기질은 결합 부위가 따로 떨어져 있을뿐 아니라, 두 결합이 열역학적으로 독립적어 있어 반응 중에 삼중 복합체를 쉽게 형성하며 반응 효율을 높일 것으로 예측된다. 본 결과들은 리간드 결합에 의한 큰 도메인들 운동의 열역학적 특성에 대한 규명을 이해하는데 있어 도움을 줄 것이다.

Enzyme I (EI) of the bacterial phosphoenolpyruvate: sugar phosphotransferase system can be auto-phosphorylated using PEP and transfers the phosphoryl group to the phosphocarrier protein HPr. Domain motions are central to biological functions of many proteins. EI which is the first protein to initiate a series of phosphotransfer reactions consists of two domains connected by the linker helix: the N-terminal domain (EIN) which is composed of a catalytic EINαβ subdomain, and an HPr binding EINα subdomain, and the C-terminal domain (EIC) which is a PEP binding domain. Here we employed different domain-deletion constructs to dissect and characterize the domain-domain motions coupled with ligand binding of unphosphorylated EI using isothermal titration calorimetry (ITC) . We demonstrated that the free energy of the hinge motion (△G = 1.5kcal/mol) is unfavorable energy, which can be overcome by the free energy of the swivel motion. The domain motions are entropy-driven, which is caused by the changes in the inter-domain interfaces upon ligand binding and domain motions. In addition, PEP binding and HPr binding did not crosstalk with each other. The fact that two substrates can bind independently suggests that EI:PEP:HPr ternary complex can be easily formed during phosphotransfer reactions. Our results will help understand the thermodynamics of large domain-domain motions associated with protein-ligand interactions.