연골세포 조정배지와 결정화된 지지체를 활용한 중간엽 줄기세포의 골 조직분화

Abstract

During endochondral bone formation, regulative mechanisms via transient cartilage play pivotal roles in ossification stages. In order to recapitulate endochondral differentiation microenvironmental cues, C3H10T1/2 murine mesenchymal cells were expanded with chondrocyte conditioned medium (CM) and further differentiated with osteogenic medium (OM). Priming of C3H10T1/2 cells via CM expansion resulted in enhanced expression level of chondrogenic markers such as aggrecan, type II, X collagen and Sox9 rather than osteogenic genes. Furthermore, CM expansion resulted in reduced expression levels of osteogenic genes such as ALP, type I collagen, osteocalcin, and Runx2. However, C3H10T1/2 cells showed enhanced osteogenic differentiation as indicated by increased ALP 2 (Alkaline phosphatase) and Alizarin Red S stainings upon osteogenic factor exposure followed by chondrocyte-conditioned medium. In addition, CM expanded C3H10T1/2 mesenchymal cells were seeded onto mineralized scaffolds fabricated with polydopamine and SBF implanted in critical-sized calvarial defect mouse models. After 8 weeks of implantation, mouse skulls were collected, and bone tissue regeneration were evaluated by micro-CT imaging and Massons trichrome (MTC) staining. In accordance with in vitro analysis, the scaffold seeded CM expanded C3H10T1/2 resulted in high level of bone regeneration compared to the scaffolds seeded GM expanded C3H10T1/2 cells. In conclusion, chondrocytes-conditioned factors in along with mineralized micro-environment can simulate the bone forming environment of mesenchymal cells.

발생단계의 연골내골화 과정에서 물렁뼈조직이 연계된 일련의 조절 기작은 중요한 역할을 수행한다. 위와 같은 미세 환경을 조성하기 위해 본 연구에서는 쥐의 중간엽 세포인 C3H10T1/2 세포주를 연골세포 조정배지에서 배양한 뒤 골 분화 배지를 처리하여 골 조직분화를 유도하였다. 연골세포 조정배지에서의 배양을 시행했을 때 C3H10T1/2 세포주는 향상된 아그리칸, 2형 및 10형 콜라겐, Sox9 등의 연골분화 관련 유전자의 발현 정도를 보였지만 ALP, 1형 콜라겐, 오스테오칼신, Runx2 등의 골분화 관련 유전자의 발현에 있어서는 오히려 감소된 발현 정도를 보였다. 그러나 이후 시행된 골 분화 배지를 이용한 배양에서는 연골세포 조정배지에서 배양되었던 C3H10T1/2 세포가 해당 단계를 거치지 않은 세포에 비해 향상된 ALP 및 Alizarin red S 염색 결과를 나타내었고 높은 골분화 관련 유전자의 발현 정도를 나타내었다. 결정화 된 지지체에서의 세포의 골 분화 정도를 확인하기 위해 본 실험에서는 홍합접착 유래 폴리도파민과 의사체액을 이용하여 지지체의 결정화를 유도하였고 C3H10T1/2 세포주를 적용한 뒤 생쥐 두개골 결손모델에 적용하여 생체 내에서의 골 조직 형성 정도를 확인하였다. 마이크로 CT 기법과 Massons trichrome 염색법을 통해 생체 내에서 연골세포 조정배지에서 배양된 C3H10T1/2 세포주가 적용된 지지체가 그렇지 않은 지지체보다 더 향상된 골 조직 형성을 수행했으며 실험실 단계의 실험 결과와 유사성을 확보하였다. 이를 통해 본 연구에서는 연골세포 조정배지와 결정화 된 지지체가 중간엽 줄기세포의 골 조직 형성에 기여한다는 것을 확인하였다.