ReCLIP 방법을 이용한 DNA 복제 인자와 결합하는 단백질 분리에 관한 연구

Abstract

진핵 세포에서 일어나는 DNA 복제는 생명의 연속성을 유지하는데 필수적인 과정이다. 이 과정 속에서 CMG 복합체는 (Cdc45/GINS 복합체/MCM2-7 복합체) DNA 복제 개시뿐만 아니라 복제 신장 단계에서 두 가닥의 DNA를 단일 가닥으로 풀어주는 DNA Helicase로서 중요한 역할을 담당하는 것으로 잘 알려져 있다. S기 동안 CMG 복합체는 복제기구(replisome)의 중요한 구성요소로서 복제 과정에서 역동적으로 움직이면서 수많은 단백질들과 함께 결합을 한다. 따라서 본 연구는 CMG 복합체를 구성하고 있는 단백질들을 연구 대상으로 선정하여 TAP (Tandem Affinity Purification) method와 ReCLIP (Reversible Cross-Link Immuno-Precipitation) method를 함께 사용하였고, 세포의 핵 속에서 일어나는 단백질들 간의 결합을 확인하고자 하였다. 그리고 이를 위해서 CMG 복합체를 구성하는 단백질인 Cdc45, Mcm2, Sld5와 TAP tag(N-terminal 또는 C-terminal)을 pIRESpuro3 Vector 내에 함께 삽입하였고, 제작한 재조합 DNA에 의해서 발현되는 단백질의 발현량을 일정하게 유지하기 위하여 stable cell line을 제작하여 실험에 사용하였다. 다음으로는 이 세포를 이용하여 인간 세포 내에서 TAP tag를 이용한 연속적인 2번의 Affinity Purification 실행 가능여부를 확인하였으며, 그 결과 성공적으로 TAP-Sld5가 정제되었을 뿐만 아니라 low salt buffer (50mM Potassium Acetate) 환경에서는 세포 내에서 Sld5와 함께 CMG 복합체를 형성하는 Cdc45, Mcm2를 함께 확인되었다. 하지만 시료의 순도를 높이기 위하여 high salt buffer (300mM Potassium Acetate)를 사용하는 경우 low salt buffer를 사용한 실험 결과에 비해 단백질 간의 결합이 줄어드는 것을 확인하였다. 이를 보완하기 위하여 두 단백질 간의 결합을 가역적으로 조절할 수 있는 Cross-linker (SDAD)를 사용하였다. Cross-linker를 처리한 후에는 high salt buffer (300mM Potassium Acetate)로 bead를 세척하여도, TAP-Sld5와 Mcm2 사이의 결합이 강하게 유지되는 것이 확인되었다. 이를 통하여 TAP method와 ReCLIP method를 함께 이용하여 인간 세포의 핵 속에서 일어나는 단백질 간의 결합을 확인 할 수 있음을 확인할 수 있었다. 따라서 이 실험 결과는 아직까지 밝혀지지 않은 새로운 단백질 간의 결합을 연구하는데 큰 기여를 할 수 있을 것이다.