Real-time Fluorescence-Raman (Dual Modal) Endomicroscopic Imaging System for Multiplexed Diagnosis

Abstract

최근, 살아있는 동물을 대상으로 질병의 조기진단이나 치료, 질병의 진행상황을 감시하기 위한 목적으로 형광 염료, 양자점, 단일 벽 탄소 나노튜브, 귀금속 나노구조체를 활용한 광학 다중 생체 이미징 기술이 발전되어 왔다. 특히, 금이나 은과 같은 귀금속 구조체의 표면에 분자가 흡착 되었을 때 라만 산란 신호가 크게 증가되는 표면 증강 라만 산란 현상을 활용한 귀금속 나노 표지자는 생체 내 다중 측정에서 필요한 민감도와 다중 측정 능력을 제공할 수 있다. 표면 증강 라만 산란 신호는 신호 폭이 좁으며, 여기 광의 선택이 자유롭고, 광 분해가 일어나지 않아 다수의 표지 신호를 한꺼번에 측정이 가능하기 때문에 다중 측정에 있어서 상당한 장점을 가지고 있다. 이러한 이유로 표면 증강 라만 산란 기술은 생체 내 다수의 표적물에 대한 다중 이미징 기술에 많이 활용되고 있다. 이 뿐만 아니라 보다 효과적인 생체 내 다중 측정을 위해 형광, 라만, 양자점을 이용한 방법들의 장점을 융합하여 활용하는 기술도 많이 보고 된 바 있다. 본 연구에서는 형광의 강한 신호세기와 라만의 다중 측정 능력의 장점을 동시에 활용하기 위해, 형광과 SERS 신호를 동시에 방출 할 수 있는 형광-SERS 표지자를 사용하여 표적된 물질의 형광 신호와 SERS 신호를 동시에 측정이 가능한 실시간 형광-라만 내시경형 이미징 시스템을 고안하였다. 이를 위해, 실시간 형광-라만 내시경형 이미징 시스템은 1) 이중 축 레이져 탐색부, 2) 형광과 라만 신호의 분리부, 그리고 3) 광 신호 측정부로 구성하였다. 또한, 형광 신호로는 RITC, 라만 신호는 RITC, FITC, 4-ABT를 가진 서로 다른 세 가지의 형광-라만 표지자 (F-SERS dots)을 합성하였다. 본 시스템을 활용하여 형광-라만 표지자 시료를 측정하였고, 시료로부터 받아들인 신호의 형광 신호와 SERS 신호를 성공적으로 분리하였다. 이 때, 형광 신호는 표적된 표지자의 위치를 파악할 수 있도록 형광 이미지를 구현하는 데 사용되며, SERS 신호는 F-SERS dots의 종류를 구별하는데 사용된다. 본 시스템은 형광 이미지를 실시간으로 제공할 수 있기 때문에 (초당 12장의 이미지), 실시간으로 표지자의 위치 추적이 가능하다. 또한 본 시스템은 광섬유 다발을 이용하여 측정하도록 고안되어 있으므로, 광섬유 기반의 내시경 기술이 가진 장점을 동일하게 갖고 있다. 반면, 광섬유 다발 고유의 강한 라만 신호가 라만 신호의 측정 가능 영역을 감소시키기도 한다. 이를 해결하기 위해, 광섬유 다발 고유의 라만 신호가 약한 영역을SERS 신호가 측정 가능한 영역으로 선정하여, 해당 위치에서 강한 라만 신호를 갖는 라만 화합물을 선정하였다. 또한 본 시스템의 목적인 생체 내 다중 이미징 기능을 증명하기 위해 슬라이드 글라스와 유사 생체 조직 위에 분포되어있는 F-SERS dots을 본 시스템을 이용하여 측정하였으며, 형광 이미지와 SERS 스펙트럼을 동시에 실시간으로 얻을 수 있었다. 본 실험 결과를 통해 본 연구에서 개발한 실시간 형광-라만 내시경형 이미징 시스템은 형광의 강한 신호세기와 라만의 다중 측정 능력의 장점을 동시에 활용하여 생체 내 다중 진단 이미징 기술에 활용이 가능할 것이라 판단된다.

Recently, sensitive optical bio-imaging techniques have been developed for pre-diagnostics of disease, therapeutic application, and monitoring of disease progression in living animal using fluorescence dye, quantum dot, single walled carbon nanotube and noble metal nanoparticle (NP). Especially, by utilizing Surface Enhanced Raman Scattering (SERS) effect noble metal NP can provide high sensitivity and high multiplexing capability, which are requested for in vivo multiplex bio-imaging. The SERS signal has significant advantages for multiplexed detection: A narrow spectral band of less than 1 nm, photo-stability with non-bleaching feature, and flexible selectivity of photo-excitation source. Owing to these advantages, SERS active nanoprobes can be used for multiplexed imaging of numerous bio-targets on tissues or organs. Several groups have reported that specific advantages of fluorescence, quantum dots, and Raman spectroscopy can be combined, in order to get additional functionality in in vivo multiplex bio-imaging. In this study, we designed the real-time fluorescence-Raman (dual modal) endomicroscopic imaging system (FREIS) for multiplexed diagnosis with fluorescence-SERS active nanoprobes (F-SERS dots) based on fiber-optic light collection and two-dimensional laser scanning system. FREIS can simultaneously detect the fluorescence and SERS signal taking advantages of intense signal of fluorescence and multiplex capacity of Raman scattering. For this purpose, FREIS was designed to consist of three components: i) Dual-axis laser scanning unit, ii) a separation unit of fluorescence and Raman signals, iii) light detection unit with a photodiode for fluorescence signal and a spectrometer equipped with a CCD detector for SERS signal. The synthesized fluorescence-SERS active dots (F-SERS dots) were composed of silver NP assembles on silica backbone, and silica shell doped with rhodamine B isothiocyanate (RITC) and silver NPs were labeled with three kinds of Raman compounds for multiplexing: Rhodamine B isothiocyanate (RITC), fluorescein isothiocyanate (FITC), and 4-aminothiophenol (4-ABT). Fluorescence and SERS signal are successfully separated each other by two optical filters. The fluorescence is utilized for imaging the targeted positions by F-SERS dots, and SERS signal is utilized to distinguish the kinds of three different F-SERS dots. Combining with F-SERS dots, FREIS can provide real-time fluorescence images (12 images/s). Since this imaging system is based on the optical fiber bundle, it has significant advantage like fiber optics-based endomicroscopy. However, optical fiber bundle gives a strong intrinsic Raman scattering background by optical fiber itself, which increases optical noises and reduces the spectral window for Raman spectroscopy. To circumvent this problem, a spectral window with less background noises was selected and fluorescence dye and Raman reporter molecules were chosen to fit in the selected spectral window. As a proof-of-concept experiment, various concentration of the F-SERS dots were measured on the slide glass and the phantom tissues using FREIS. These results exhibit that the developed imaging method comprised of the optical system and F-SERS probes can be applied to real-time in vivo multiplex bio-imaging.