Cyto-genotoxicityofN-nitrosodimethylamineinhumanlymphocytes

Abstract

N-nitrosodimethylamine (NDMA) 은 가공된 고기류, 햄, 훈제 생선, 맥주 와 같은 식품에 포함되어 있으며, 강력한 간독성 물질로서 발암물질 과 돌연변이 유발물질로 알려져 있다. NDMA 는 식품 속에 포함된 아질산염 ( NO₂) 과 secondary amine 인 demethylamine 이 반응하여 체내에서 발생할 수 있고, 연소가스를 이용한 식품의 건조나 가열하는 과정에서 발생할 수 있다. NDMA 가 대사를 일으켜서 세포손상을 유발하는데 중요한 역할을 하는 Cytochrome P450 2E1(CYP450 2E1)은 여러 화학물질과 알코올의 독성을 유발하는데 큰 위치를 차지하며, 간세포에 많이 들어있는 것으로 알려져 있다. 최근에 이 효소는 간세포 이외에 사람 림프구 에서도 발현되는 것으로 보고되고 있으며, NDMA 가 사람 림프구에서 CYP2E1을 통해 혈액에서 대사되어 독성을 유발 할 가능성이 있다. 하지만 NDMA 에 의한 인체 독성 평가는 거의 간 독성에서 주로 이루어졌으며, 혈액독성에 의한 독성평가 및 기전에 관한 연구는 거의 이루어지지 않았다. 따라서, 본 연구는 사람 림프구에서 NDMA 에 의해 일어나는 세포 유전독성 정도를 소핵 분석, 단세포 전기 영동 법, 유세포 분석을 통한 세포 내 활성 산소 종의 측정, 세포 자사멸 및 세포주기 억류 측정 등 다양한 분자 독성 기법을 시옹하여 평가하고자 하였다. 사람 림프구에서 세포 생존률은 NDMA 의 농도가 증가함에 따라 감소하였고, 소핵분석에서 음성으로 나타났지만, 단세포 전기영동법 분석에서 DNA 손상이 양-반응적으로 증가함을 확인하였다. 또한 NDMA 에 의한 세포사멸은 나타나지 않았지만, G1 단계에서 세포주기 억류과정을 유발하는 것을 유세포 분석을 통해서 확인할 수 있었다. 또한, NDMA 를 처리한 세포에서 세포 내 활성산소종 수준이 현저히 증가하였고, 항산화제인 N-acetylcysteine (NAC)에 의하여 활성산소종의 발생이 감소함을 관찰 하였다. 그리고 NDMA 와 NAC 을 함께 처리한 세포에서 DNA 손상과 G1 단계의 세포주기 억류 정도가 현저히 줄어드는 것을 확인 함으로써, 사람 림프구에서 NDMA 에 의해 유발된 독성에 대한 NAC 의 보호효과를 확인할 수 있었다. 결론적으로 NDMA 는 사람 림프구에서 활성산소종을 발생시켜 DNA 손상을 증가 시킴으로써 세포주기 억류를 유발했다. 위와 같은 결과를 바탕으로 간세포에 한정되어 있는 NDMA 에 대한 독성평가에 중요한 자료로 제공될 수 있을 것으로 기대된다.

N-nitrosodimethylamine (NDMA), present in many foodstuffs such as cured meat, cooked ham, smoked fish, and alcoholic beverages. It is known to be a potent carcinogen and to cause acute hepatotoxicity. NDMA requires metabolic activation to exert its mutagenicity and carcinogenicity. Cytochrome P450 2E1 (CYP2E1) plays a major role in this activation. CYP2E1 is mainly included in hepatocytes, in which it has been commonly studied regarding NDMA-induced toxicity. CYP2E1 was also found in human lymphocytes, but little is known about whether NDMA has harmful effects in this type of cells. In the present study, the cyto-/genotoxicity of NDMA on human lymphocytes was found by trypan-blue assay, single-cell gel electrophoresis (comet) assay, cytokinesis-block micronucleus (CBMN) assay and flow cytometry. Exposure of cells to various concentrations of NDMA (10, 25, 50, 100, and 150mM) for 48 hr significantly decreased cell viability and induced DNA damage resulting from DNA strand breaks in a dose dependent manner, but the frequency of MN is not increased in human lymphocytes. Moreover, I found that Hypodiploid sub-G1 apoptosis peak showed no change, suggesting that NDMA is not related to apoptotic cell death. However, NDMA caused cell-cycle arrest at Go/G1 phase, and cytokinesis-block proliferation index (CBPI) decreased 20% in 50mM NDMA-treated cells and 40% in 150mM NDMA-treated cells compared to the control, respectively. In addition, intracellular ROS levels were increased with concentrations of NDMA. Pre-treatment of human lymphocytes with N-acetylcysteine (NAC), direct ROS scavenger, reduced NDMA-induced ROS release and DNA damage, and it also restored cell proliferation and decreased G1 phase cell arrest. Through these result, I found the protective effect of NAC against NDMA-induced toxic effects in human lymphocytes. In conclusion, NDMA induces DNA damage via ROS generation, which triggers cell-cycle arrest in human lymphocytes. Taken together, the results of this study suggest that NDMA-mediated cyto-/genotoxicity in human lymphocytes through generation of ROS.