신규합성펩타이드의 혈관형성제어에 미치는 영향

Abstract

신규합성펩타이드의 혈관형성제어에 미치는 영향

1. 목 적

골형성단백질 (Bone morphogenic proteins, BMPs)는 transforming growth factor β (TGFβ) superfamily 에 속하는 세포 외 신호전달 분자로서 세포사멸, 혈관신생에도 영향을 준다. transforming growth factor β (TGFβ) superfamily에 속하는 단백질들은 헤파린결합부위를 포함하며, BMP4의 헤파린결합부위는 heparin과 결합하여 중요한 생리기전을 일으킬 수 있는 것으로 보인다. VEGF는 heparin-binding domain(HBD)를 포함하며, 이 부분이 haparan sulfate (HS) 세포 외 기질과 작용하여 VEGF를 고착시키고 angiogenesis에 중요한 역할을 한다. Smurf는 TGF-β signaling을 조절하는 것으로 처음 알려졌고 이후 연구들에 따르면 Smurf는 다양한 세포 내 단백질들에 작용하여 세포증식, 분화, 전이를 조절하는 것으로 보인다. 본 연구에서는 이러한 단백질들의 결합부위들을 도출하여 한분자로 가교제작, 신규합성펩타이드를 합성하여 정제한 뒤 종양세포에 미치는 영향을 알아보고자 하였다. 제작된 합성 peptide는 HUVEC을 이용, 혈관형성에 미치는 영향을 관찰하였다.

2. 방 법

2.1. Cell viability test: Test peptide, 대조군펩타이드, VEGF, BMP4를 농도별로 MDA-MB-231 cell, HUVEC에 처리하여 각 펩타이드의 세포독성을 측정한다. MTT assay를 이용하여 cell viability를 측정했다.

2.2. Tubular formation assay: Test peptide, 대조군펩타이드, VEGF, BMP4를 농도별로 MDA-MB-231 cell에 처리한 TCM을 수확하여 24-well plate에 matrigel 도포후 각 TCM 내에서 HUVEC의 tubular formation을 관찰했다.

2.3. Cell migration: 6-well plate에 HUVEC seeding후 p200 pipet tip으로 직선을 그어서 세포가 없는 선을 만들고 TCM 하에서 이동한 세포의 수를 확인하였다.

2.4. Western blot: TCM에서 배양한 MDA-MB-231 cell lysate를 MMP1, MMP2, MMP9에 대해서 western blot을 수행했다.

3. 결 과

Test peptide의 농도가 증가함에 따라서 MDA-MB-231 cell의 경우 세포 증식이 억제되고 세포 사멸이 유도되었으며, HUVEC에 대해서는 control group의 cell viabilty와 유의할만한 차이를 나타내지 않았다. Tubular formation assay에서 Test peptide의 농도가 증가함에 따라서 HUVEC이 형성하는 tubule의 수가 감소했고 대조군펩타이드의 경우 농도와 관계없이 control group과 유사한 tubular formation을 보였다. Cell migration assay에서Test peptide의 농도가 증가함에 따라서 migration한 세포의 수가 증가했고 대조군펩타이드의 경우 control group과 유의할 만한 차이를 나타내지 않았다. Western blot에서 Test peptide의 농도가 증가함에 따라서 MMP1, MMP2, MMP9의 발현량이 감소하였고 대조군펩타이드의 경우는 control group과 유사한 결과를 나타냈다.