Activity-dependent modulation of synaptic vesicle retrieval mechanisms at CNS synapses

Abstract

전형적인 중추신경계의 시냅스는 한정된 개수의 시냅스낭을 함유하고 있다. 반복적인 자극에 대응하여 계속적으로 신경 전달 물질을 분비할 수 있으려면 세포 내 함입 과정과 시냅스낭 재생성 및 순환 과정을 통해 신경 전달 물질을 함유한 시냅스낭이 빠르게 보충되어야 한다. 이러한 시냅스낭의 이입 과정은 clathrin-mediated endocytosis (CME) 과정이 독점적으로 관여한다는 보고가 있었으나, 최근 ultrafast endocytosis 나 bulk endocytosis 와 같은 clathrin-independent endocytosis (CIE) 과정이 더 우세하게 작용한다는 것이 보고된 바 있다. 그러나 신경 세포가 신경 활성 상태에 따른 CME 과정과 CIE 과정에 대하여 어떤 방법을 이용하여 시냅스낭 이입 과정을 일으키는지에 관해서는 아직 연구된 바가 없다. 본 연구에서는 초대 배양한 해마 신경 세포를 저주파 (5 Hz) 와 고주파 (40 Hz) 로 나누어 자극을 주어 신경 활성 상태에 따른 시냅스낭 이입 과정이 어떻게 조절되는지 확인하는 실험을 진행하였다. 5 Hz 와 같은 저주파의 자극이 들어가는 동안에는 오로지 CME 과정을 통한 시냅스낭 이입 과정만이 일어난다는 것을 확인하였다. 이는 Brefeldin A (BFA) 를 처리하거나 adaptor protein (AP) -1/ -3를 knockdown 시킴으로써 CIE 과정을 저해하였을 때, 5 Hz 자극이 들어가는 동안에, 어떠한 시냅스낭 순환 과정의 저해를 보이지 않았다는 것을 통해 이를 증명하였다. 그러나, PITSTOP 2 를 처리하거나 clathrin heavy chain (CHC) 을 knockdown 시킴으로써 CME 과정을 저해했을 때는, 자극이 들어가는 초기 (약 10 초까지) 의 시냅스낭 이입이 차단되다가 이후 CME 과정의 결핍을 보상하기 위해 CIE 과정을 통하여 시냅스낭 이입 과정을 재개한다는 것을 확인하였다. 또한 자극이 끝난 이후의 시냅스낭 이입은 CIE 과정의 저해는 영향을 주지 않지만, CME 과정의 저해는 이입 과정의 속도를 느리게 만든다는 것을 확인하였다. 위 결과와 반대로, 40 Hz와 같은 고주파 자극이 들어가는 동안에 일어나는 시냅스낭 이입 과정은 약간의 지연 이후에 CIE 과정이 중점적으로 일어난다는 것을 확인하였다. 이는 CME 과정을 저해 시켰을 때는 아무런 영향이 없었던 것과 달리 CIE 과정을 저해 시켰을 때 시냅스낭 이입 과정이 완전히 차단된다는 것을 통해 증명하였다. 또한 자극이 끝난 후의 이입 과정도 CME 과정의 저해는 영향을 주지 않으나, CIE 과정이 저해되면 현저히 느리게 일어난다는 것을 확인하였다. 위 결과를 토대로, 자극이 들어가는 동안에 성숙한 신경세포가 신경 활성에 기반하여 CME 과정과 CIE 과정을 다르게 사용한다는 것을 증명하였다. 또한 한쪽 방법이 저해되면 다른 방법을 재개하여 이러한 결핍을 보상한다는 것을 확인하였다. 위 연구를 통해 신경세포가 활성 상태에 따른 시냅스낭 이입 방법의 효율적인 변화와 보상작용을 확인했다는 것을 고려해 볼 때, 이러한 연구 결과는 궁극적으로 신경 전달 물질 방출과 시냅스 가소성 연구에 이바지 할 것을 제시한다.

Typical central synapses contain a limited number of synaptic vesicles (SVs). To continuously release neurotransmitters in response to repetitive stimulation, the SVs need to be quickly replenished through endocytosis and recycling. Previous studies proposed that SV retrieval occurs exclusively via clathrin-mediated endocytosis (CME). Recently however, some reports have challenged this view and suggested that clathrin-independent endocytosis (CIE) via either ultrafast endocytosis or bulk endocytosis is functional instead. In this study, I examined how neurons use CME and CIE depending on different neuronal activity in primary cultured hippocampal neurons since neuronal activity may modulate the mode of SVs retrieval. I found that during low-frequency stimulation at 5 Hz, SVs were retrieved mostly via CME. Accordingly, inhibition of CIE by Brefeldin A (BFA) treatment or adaptor protein (AP)-1/AP-3 Knockdown (KD) did not affect SV retrieval during 5 Hz stimulation. However, when CME was blocked via clathrin heavy chain (CHC) KD or PITSTOP 2 treatment, which is an inhibitor between amphiphysin and clathrin, SVs initially underwent endocytosis for approximately 10 s of stimulation, after which time CIE became operative and compensated for the deficiency of CME. Moreover, endocytosis after stimulation was not affected by CIE inhibition whereas CME inhibition resulted in a slow rate of endocytosis. In contrast, during high frequency stimulation at 40 Hz, I found that after a brief delay, SVs were retrieved exclusively by CIE since the blockage of CIE completely abolished the endocytosis during stimulation while CME inhibition did not affect during-stimulus endocytosis. Post-stimulus endocytosis also was not affected by CME inhibition while CIE blockage slowed the rate of post-stimulus endocytosis. These results show that mature neurons use CME and CIE pathways to different extents depending on neuronal activity to retrieve SVs during stimulation. When either one pathway is blocked, the other pathway can compensate for the deficiency. This may result in activity-dependent alteration of the SVs retrieval, which ultimately influences the efficiency of neurotransmitter release and contributes to synaptic plasticity.