Correlation between Promoter Methylation Status of ABCG2 and Drug Sensitivity in Colorectal Cancer Cell Lines

Abstract

대장암은 전세계적으로 여성에게서 두 번째, 남성에게서 세 번째로 많이 진단되는 질환이다. 수술을 통한 암세포의 제거에도 불구하고, 환자의 생존율은 암의 주기가 증가할수록 낮아지는 경향을 보인다. 생존율을 높이기 위해, 3기 또는 4기 직장암 환자의 경우 수술 이외에 화학적, 방사선적 요법이 추가적으로 적용되기도 한다. 화학적 치료가 실시되는 도중에 중대한 문제점 중 하나는 환자에게서 발견되는 약물에 대한 자연 내성과 획득 내성이다. 항암제 내성이 획득되는 주요한 경로 중 하나는 에너지 의존적 약물 방출 펌프인 MDR1, MRP 그리고 ABCG2 유전자의 과 발현에 기인한다. 유전자 발현 조절 장치 중 하나인 DNA메틸화 기작을 통해ABCG2의 발현이 억제되는 현상이 여러 논문에서 관찰되었다. 또한 대장암 치료제인 5-FU, irinotecan, oxaliplatin은 ABCG2의 기질임과 동시에 ABCG2 발현이 증가되었을 때, 그 내성이 증가한다는 사실이 알려져 있다. 이 사실을 바탕으로 본 연구에서는 32개 직장암 세포주에서 ABCG2의 프로모터 부위의 메틸화 양상을 MS-PCR, bisulfite sequencing analysis를 통해 관찰하였고, 역전사 PCR과 실시간 PCR을 통한 mRNA 발현 양상과 비교하였다. 그 결과, 32개 직장암 세포주 중 13개 세포주에서 mRNA 발현이 감소되어 있거나 억제되어 있었고, 이 중 3개 세포주에서 20% 이상의 ABCG2 촉진 유전자의 CpG 섬 부위의 메틸화가 관찰되었다. 위 3개 세포주 (SNU-C4, Ls174T, NCI-H716)에서 ABCG2 유전자가 DNA 메틸화에 의한 발현 억제 조절을 받고 있다는 사실을 확인하기 위해, 탈메틸화 약제인 5-aza-2-deoxycytidine을 처리 한 뒤 발현 회복 양상을 관찰하였다. 역전사 PCR과 실시간 PCR에서 위 세가지 세포주의 ABCG2 메신저 RNA의 발현 회복이 관찰되었다. 메틸화 제거 기작에 의한 ABCG2 유전자 재발현 현상이 항암제 감수성이 미치는 영향을 알아보기 위해 5-aza-2-deoxycytidine를 처리한 SNU-C4, Ls174T, NCI-H716 세포주에 5-FU, irinotecan, oxaliplatin을 적용하고, WST-1 검사법을 이용해 450 nm에서 측정한 흡광도로 세포 생존도를 분석하였다. 5-aza와 5-FU또는 oxaliplatin이 함께 처리된 SNU-C4 세포주에서 약제 감수성이 감소하였고, Ls174T 세포주에서는 모든 약제에 대한 감수성이 유의하게 감소된 반면에, NCI-H716 세포주에서는 유의한 약제 감수성의 변화가 관찰되지 않았다. 결론적으로, 일부 대장암 세포주에서 ABCG2 프로모터의 CpG 섬 부위의 탈메틸화는 ABCG2 유전자 발현을 증가시키며, ABCG2 유전자 발현이 증가함으로 인해 대장암 치료제인 5-FU, irinotecan 그리고 oxaliplatin의 약제 감수성이 감소되는데 영향을 미치는 것으로 보인다. 이로써, ABCG2의 과발현은 항암제 내성을 가지는 대장암 환자에게서 약제 내성을 판별할 수 있는 marker로 이용 될 가능성이 있으며, 프로모터 부위의 메틸화 양상을 조사하여 특정 약물에 대한 감수성을 파악할 수 있게 된다면 화학적 요법의 치료 효율을 높일 수 있을 것이라 전망된다.

Colorectal cancer (CRC) is the second most commonly diagnosed cancer in worldwide. Although colon cancer is possible to cure by surgery, chemotherapy, and radiotherapy, however, the incidence rate of recurrence and metastasis are still high. One of the reasons is that resistance of chemotherapy. ATP-binding cassette protein G2 (ABCG2) as a drug efflux pump contains a 655-amino-acid polypeptide transporter with six transmembrane domains forms a homodimer on plasma membranes. Therapeutic drugs for colorectal cancer patients such as 5-FU, irinotecan and oxaliplatin have been identified as substrates of ABCG2. DNA methylation of the ABCG2 promoter site, which consists of many CpG islands, could play a role in the epigenetic regulation of gene expression. In this study, I investigated whether the methylation status of ABCG2 promoter was related to drug sensitivity. I studied expression patterns of ABCG2 and methylation status of the promoter. First, I analyzed the mRNA expression levels of ABCG2 by conducting RT-PCR and qRT-PCR. MS-PCR and bisulfite sequencing analysis were performed to identify methylation status of the ABCG2 promoter site. According to the results, the ABCG2 mRNA level was shown low in 13 cell lines (SNU-283, SNU-769B, SNU-1040, SNU-1047, SNU-C4, Colo201, Colo320, HCT 15, Ls174T, NCI-H716, SW403, SW480 and SW1116). Promoter methylated CRC cell lines, SNU-C4, Ls174T and NCI-H716 were selected and the cell proliferation assay for anticancer drugs was performed after 5-aza-2-deoxycytidine (5-aza) treatment. As results, the ABCG2 mRNA expression level was increased when 5-aza was treated with the cell lines, in addition, demethylation was induced by 5-aza which enhanced the ABCG2 expression in the cell lines, and the cell viability recovered in the cell lines with re-expressed ABCG2 and this recovery was inversely correlated to drug sensitivity. Taken together, I found that ABCG2 gene expression, regulated by promoter methylation, changes drug sensitivity in some CRC cell lines. Thus, this study suggests that DNA methylation of ABCG2 promoter sites can be a chemotherapeutic resistance marker for colorectal cancer patients who have resistance to anticancer drugs.