T2* Magnetic resonance imaging of U-87 human glioblastoma using 5-aminolevulinic acid induced heme synthesis in an animal model

Abstract

서론: 이 실험은 자기공명영상(MRI)를 이용하여 뇌종양의 악성 부분을 영상화하는 새로운 기술 개발을 목표로 하였다. 5-아미노레불린산(5-ALA)을 주입하면 프로토포르피린 IX(protoporphyrin IX, PpIX)이라는 형광 물질이 악성 신경교종에 축적되게 되며, 이를 이용해서 광범위적으로 침습적인 신경교종 수술에서 악성 부분을 찾을 수 있다. 프로토포르피린 IX는 미토콘드리아의 페로케라타아제(ferrochelatase, FECH)에 의해 철(ferrous iron)과 결합하여 헴(heme)으로 합성된다. 이와 같은 대사 과정이 있음을 바탕으로 5-ALA의 주입 후 헴(heme)의 합성이 악성 신경교종에서 증가 함을 증명하고, 헴의 초상자성(superparamagnetic)을 이용하여, 헴이 축적된 악성 종양 부분을 자기공명영상으로 영상화 하기 위해 생체외 실험과 생쥐 뇌 악성종양 모델을 이용한 생체내 실험을 계획하였다.

방법: 생체외 실험에서는 사람 악성 신경교종 세포주 U-87에 5-아미노레불린산을 처리한 군과 처리하지 않은 군으로 실험 군을 나누었으며, 각 세포군에서 1, 24, 48시간 후의 세포내 철, 헴, 프로토포프피린 IX, 페로케라타아제의 양을 측정하였다. 생쥐 뇌 악성 종양 모델 총 10마리를 이용하여 생체내 실험을 수행하였다. 이중 6마리는 자기공명영상 촬영 24시간 전에 5-아미노레불린산을 경구로 투여받았고, 4마리는 식염수를 경구로 투여 받았다. 자기공명영상은 종양이 있는 부분을 중심으로 관상면으로 T2와 T2* 강조영상 촬영하였고, 이를 MATLABTM (MathWorks Inc.)프로그램을 이용한 ROI 픽셀 분석으로 T2* 지도 영상을 생성하여 분석하였다. 마지막으로 종양 조직을 적출하여 병리적 염색과 세포 내의 철을 정량화하는 방법으로 종양조직 내 철의 축적을 확인 및 비교하였다.

결과: 생체외 실험 5-아미노레블린산을 노출되었던 세포군에서 노출 후 24시간 후 세포내 철과 헴의 양이 노출되지 않았던 세포군에 비하여 통계적으로 의미있게 높았다 (1.95 ± 0.07 vs. 1.67 ± 0.07 μg/mg, P < 0.05 and 1.19 ± 0.07 vs. 0.86 ± 0.11 μg/mg, P < 0.001). 세포내 프로토포르피린 IX의 양은 5-아미노레불린산에 노출 후 1시간에 가장 높았고, 이후에는 급격하게 감소하는 양상을 보였다. 세포내 페로케라타아제의 양은 5-아미노레불린산에 노출 후 24시간에 가장 높았으며, 24, 48시간 모두에서 5-아미노레불린산을 노출되지 않았던 세포군보다 높았다. 5-아미노레불린산을 투여 받았던 생쥐 뇌 악성 종양 모델 군에서 T2* 평균 값이 생리 식염수를 투여 받았던 대조군 보다 통계적으로 낮게 측정되었다(14.9 ± 1.2 vs. 21.4 ± 2.6 ms, P < 0.0001). 또한 5-아미노레불린산을 투여 받기 전 T2* 값에 비하여 통계적으로 유의하게 투여 후 T2* 값이 감소하였다. 마지막으로 종양 적출 후 측정한 종양 내 철 농도는 유의하게 대조군 보다 높았다.

결론: 5-아미노레불린산의 투여 후, 악성 신경교종에 헴의 축적이 유의하게 증가함을 확인할 수 있었으며, 이에 의하여 자기공명영상 T2* 신호의 감소룰 확인할 수 있었다. 따라서 앞으로 5-아미노레불린산 이용한 자기공명영상이 광범위적으로 침습적인 신경교종에서 악성 부분을 찾아내는데 유용한 기술이 될 가능성이 있으며, 인간 대상 연구에서도 여러 분야에 이용 될 수 있을 것이다.

Background and Purpose: This study developed a new technology for visualizing malignant foci in brain tumors using magnetic resonance imaging (MRI). Administration of 5-aminolevulinic acid (5-ALA) causes an accumulation of fluorescent protoporphyrin IX (PpIX) in malignant gliomas, which can be used as a marker for the detection of malignant foci in diffusely infiltrating gliomas. Here, we demonstrate that heme synthesis induced by 5-ALA could be detected using in vivo MRI. In this approach, the heme is made superparamagnetic as mitochondrial ferrochelatase (FECH) incorporates ferrous iron into PpIX, and cells that accumulate PpIX act as the MRI contrasting agent by employing endogenous iron, thereby simplifying the identification of malignant foci. Materials and Methods: In vitro experiment, we measured intracellular iron, heme, PpIX and FECH at 1, 24 and, 48 h after in the human glioblastoma cell line U-87 treated with or without 5-ALA. In vivo experiment, a total of 10 mice with orthotopic brain tumors were used in this study. The mice received an oral administration of 5-ALA (n = 6

5-ALA group) or normal saline (n = 4

control group) 24 h before MRI. MRI was administered before and 24 h after the oral intake of 5-ALA or normal saline. For the analysis of T2* in the brain tumors, we generated T2* maps of the ROIs using pixel-by-pixel analyses in MATLABTM (MathWorks Inc.). Then, mice were sacrificed for histology and measurement of intratumoral iron levels. Results: In vitro experiment, the intracellular iron and heme levels of cells exposed to 5-ALA were higher than those of control cells at 24 h (1.95 ± 0.07 vs. 1.67 ± 0.07 μg/mg, P < 0.05 and 1.19 ± 0.07 vs. 0.86 ± 0.11 μg/mg, P < 0.001). The intracellular PpIX concentration was increased at 1 h after exposure to 5-ALA but had decreased by 24 and 48 h. Treatment with 5-ALA resulted in the greatest intracellular concentration of FECH at 24 h posttreatment (0.315 ng/mg protein, P < 0.01), and the intracellular concentration of FECH at 24, 48 h was higher in cells treated with 5-ALA as compared those untreated (P < 0.001). In vivo experiment, the mean T2* value of U-87 glioblastomas treated with 5-ALA was lower than that of control tumors, which received normal saline (14.9 ± 1.2 vs. 21.4 ± 2.6 ms, P < 0.0001). The mean T2* value of brain tumors significantly decreased following treatment with 5-ALA (20.6 ± 1.1 vs. 14.9 ± 1.2 ms, P < 0.0001). Intratumoral iron levels also showed a significant difference in the mean concentration of iron between the control animals and the 5-ALA-treated animals (41.4 ± 0.9 ug/g vs. 60.1 ± 2.2 ug/g, P < 0.0001). Conclusion: After administering an oral dose of 5-ALA, we report that 5-ALA dependent changes in T2* were hypointense and could be detected in brain tumors by MRI. Thus, this technology is suitable for the in vivo identification of malignant foci in diffusely infiltrating gliomas and can be used for numerous biomedical applications in human studies.