Trimethyltin-induced microglial activation and its mechanisms in BV-2 cells

Abstract

유기주석 화합물 (organotin compound)의 일종인 trimethyltin (TMT)은 중추신경계, 특히 해마 신경세포의 사멸과 신경계의 기능손상을 유발할 수 있는 신경독성물질로 알려져 있다. TMT에 의한 선택적인 신경세포의 손상 기전은 아직 명확히 밝혀져 있지 않으나, 산화성 스트레스, 미세아교세포(microglia)의 활성화와 이에 따른 염증반응 등이 중요한 역할을 할 것으로 추정되고 있다. 한편 미세아교세포의 활성화는 TMT 신경독성의 병리학적 특징의 하나로 잘 알려져 있으나, TMT가 미세아교세포를 어떤 기전으로 활성화시키는 지에 대한 연구는 제한적이다. 그러므로 본 연구에서는 TMT에 의한 미세아교세포의 활성화 기전을 알아보고자 하였다. 미세아교세포주인 BV-2 cell을 이용하여 TMT 처리 후 세포 내 활성산소(ROS)의 생성, 신호전달 경로의 활성화(MAPKs, NF-κB), nitric oxide (NO) 그리고 TNF-α 유리를 확인하였다. 또한 해마 신경세포주인 HT22 cell를 BV-2 cell과 공동배양(co-culture)하여 TMT에 의한 BV-2 cell의 활성화가 신경세포의 생존에 미치는 영향도 검토하였다. 실험 결과 TMT는 BV-2 cell에서 활성산소의 생성을 증가시키고, JNK와 p38 MAPKs의 인산화 유도와 NF-κB의 활성화 및 CD11b의 발현이 증가되는 결과를 얻었다. 그리고 TMT 처리는 BV-2 cell에서 NO와 TNF-α의 유리를 증가시켰다. NADPH oxidase 억제제인 apocynin을 전처리한 경우 TMT에 의한 활성산소의 생성 이외에도 활성화되는 신호전달경로(p38, JNK 그리고 NF-κB), 그리고 NO와 TNF-α 유리가 효과적으로 억제되는 것을 확인할 수 있었다. 한편 BV-2 cell과 HT22 cell 공동배양 조건에서는 TMT는 BV-2 cell을 활성화시켜 HT22 cell의 세포사를 초래하였다. 그리고 동일 조건에서 apocynin 그리고 SB203580 (p38 억제제), SP600125 (JNK 억제제) 를 전처리한 경우 BV-2 cell에 의한 HT22 cell의 세포사를 유의하게 억제하였다. 이상의 결과는 TMT는 BV-2 cell을 활성산소의 생성을 통한 MAPKs, NF-κB 경로를 직접 활성화시키고, 그 결과 NO, TNF-α 유리를 증가시킬 수 있으며, 유리된 NO, TNF-α 그리고 활성산소가 복합적으로 작용하여 HT22 cell의 세포사를 초래할 수 있음을 확인한 것이다.

Trimethyltin (TMT) is known as a potent neurotoxicant that causes neuronal cell death and neuropathological symptoms. The precious mechanism of TMT toxicity is still not fully understood, however, reactive oxygen species (ROS), microglial activation and recruitment of inflammatory mediators are considered to play a crucial role in the process. Microglial activation is one of the prominent pathological features of TMT neurotoxicity, despite, a limited number of studies have been reported on how microglial activation occurs in TMT intoxication. In this study, we aimed to investigate signaling pathways by which microglial activation is induced by TMT. By using BV-2 murine microglial cells, TMT-induced ROS generation, mitogen-activated protein kinases (MAPKs) and nuclear factor-κB (IκBα phosphorylation inhibitor) signaling and pro-inflammatory mediators were examined. Additionally, the effect of TMT-induced microglial activation on neuronal cell survival was examined in a co-culture with HT22 neuroblastoma cells. As a result, TMT generated ROS and increased the expression of CD11b and NF-κB-mediated nitric oxide (NO) and tumor necrosis factor (TNF)-α in BV-2 cells. We also observed that NF-κB activation was controlled by p38 and JNK phosphorylation. Moreover, TMT-induced ROS generation occurred via nicotinamide adenine dinucleotide phosphate (NADPH) oxidase in these cells. Interestingly, pretreatment with the NADPH oxidase inhibitor apocynin significantly suppressed p38, JNK, and NF-κB activation and ultimately the production of pro-inflammatory mediators upon TMT exposure. These findings indicate that NADPH oxidase-dependent ROS generation activated p38 and JNK MAPKs, which then stimulated NF-κB to release pro-inflammatory mediators in the TMT-treated BV-2 cells. In the co-cultured system, the activation of the microglia by TMT caused the death of the HT22 cells and it was significantly rescued by pretreatment of apocynin, SB203580 (p38 inhibitor) or SP600125 (JNK inhibitor). These results suggest that TMT-generated ROS and pro-inflammatory factors might cooperate to mediate neuronal death. Taken together, TMT could directly activate microglia to become deleterious to neuronal cell survival.