CD133-mediated TM4SF5 expression enhances growth and survival of liver cancer spheres

Abstract

Transmembrane 4 L6 family member 5 (TM4SF5)는 간암을 포함한 다양한 암 종에서 높게 발현되는 막단백질로서, 선행 연구를 통해 TM4SF5 단백질이 암줄기세포 표지자들 중 하나인 CD44 단백질과 결합하여 EMT (Epithelial-Mesenchymal transition, 상피-중배엽 세포 전이)현상을 통해, 간암세포의 자가복제능력에 중요한 역할을 한다는 것을 밝혀졌다. 본 연구에는 이 막단백질을 조절하는 인자가 무엇인 지를 알고자 연구하는 과정 중에 TM4SF5 및 CD44가 또 다른 암줄기세포 표지자인 CD133에 의한 연쇄적 신호전달과정을 통해 발현이 조절되고, 3차원적 배양액 환경에서 sphere의 형성 및 증식에 영향을 준다는 것을 확인하였다. CD133은 세포막을 다섯 번 통과하는 단백질 수용체로, 간암을 포함한 다양한 종류의 암에서 많이 발현하며 암줄기세포 표지자로 많이 알려져 있다. 간암에서 CD133의 높은 발현은 종양의 개시 및 전이에 영향을 미치고, 항암제의 저항성을 높여 치료를 어렵게 하는 것으로 확인된 바 있다. 간암 세포에 CD133을 과발현하면 TM4SF5와 CD44 단백질의 발현이 따라서 증가하였지만, TM4SF5를 과발현하도록 한 세포에서는 CD133과 CD44 단백질의 발현이 증가하거나 감소하지 않았다. 또한 TM4SF5 단백질 발현의 저하시키거나, CD44를 과발현하더라도 간암세포에서 CD133 단백질의 발현에 변화가 없는 것으로 보아, CD133이 TM4SF5와 CD44의 상위 조절인자의 역할을 하는 것으로 확인되었다. 이전 연구에 따르면, CD133의 세포질쪽 C-꼬리부분에는 두 개(828 및 852번)의 타이로신에 인산화가 일어나는 데, 세포질에 존재하는 c-Src가 타이로신 인산화를 일으키고, 차례로 PIP3 합성과 AKT를 활성화를 유발하는 것으로 알려져 있다. 활성화된 Akt는 GSK3β의 활동을 억제를 유도하여 β-catenin이 핵 안으로 들어가 세포의 생존을 촉진시키는 신호전달들의 전사를 위한 활성을 유도할 수 있는 것으로 알려진 바 있다. 이 때, Y828F 혹은 Y858F CD133 mutant와 두 타이로신을 동시에 페닐알라닌으로 치환환 CD133 Y828F/Y852F mutant, 그리고 세포질 쪽 C-꼬리부분(52개의 아미노산)을 완전 제거한 CD133 c-terminal deletion mutant를 발현할 경우, wildtype CD133의 경우에 대비하여 TM4SF5의 발현 정도가 줄어든 것을 확인할 수 있었다. 또한 β-catenin의 전사적 활성도를 topflash reporter assay를 통해 확인한 경우, CD133의 mutant들의 경우에서, 하위 신호인 β-catenin의 전사적 활성도가 wildtype CD133에 대비하여 감소하는 것을 확인하였다. 한편 이렇게 활성화된 β-catenin이 TM4SF5의 발현을 증가시키는 것은 TM4SF5의 promoter reporter assay를 통해 확인할 수 있었다. 따라서, 이러한 결과는 CD133이 c-Src, Akt, β-catenin의 연쇄적 신호전달 경로를 통해 TM4SF5의 발현을 조절한다는 것을 보여준다. 이러한 CD133의 과다발현된 간암세포들은 혈청 성분과 부착 환경이 미약한 수용성 3D (aqueous 3D)상황에서 sphere를 더 잘 형성하고 증식이 더 향상되었고, CD133의 mutant들을 발현하는 간암 세포의 경우에는 sphere의 형성과 증식이 훨씬 저하되었다. 한편, CD133이 과 발현된 세포에 anti-TM4SF5 reagent인 소분자화합물 TSAHC를 처리하였을 경우, DMSO 처리 대조군에 비해 sphere 형성 및 증식이 억제되는 것을 확인하였다 (IC50 = 0.3 M). 이는 CD133에 의해 TM4SF5의 발현이 조절되며, TM4SF5 단백질의 기능이 sphere를 형성하는데 중요한 역할을 한다는 것을 제시한다. 이와 같은 결과들을 종합할 때, TM4SF5 단백질은 CD133의 타이로신인산화 과정을 통해 활성화된 c-Src, Akt, 그리고 β-catenin를 포함하는 신호전달 체계에 의해 그 발현이 증가되고, 결과적으로 간암세포의 종양형성내지는 circulatory 종양세포로서의 특성을 더욱 더 가지도록 한다는 것을 시사한다고 판단된다.

Transmembrane 4 L six family member 5 (TM4SF5) is a member of the tetraspanin L6 superfamily and highly expressed in various cancers including hepatocarcinoma. Previous study showed that TM4SF5 physically interacts with CD44, one of the cancer stem cell (CSC) markers, and this interaction leads to self-renewal stemness and activates circulating properties via an involvement of Epithelial-Mesenchymal Transition (EMT) phenotypes. In this study, I investigated how TM4SF5 and CD44 could be regulated while leading to their collaboration for cellular stemness-like and circulating properties. Since CD133 is also well-known to be a cancer stem cell surface marker and a pentaspan transmembrane protein expressed by a broad range of cancers including hepatocarcinoma, I studied here how the expression of TM4SF5 and CD44 are regulated by CD133 related to their stemness-like and circulating properties. In this study, I found that overexpression of CD133 in liver cancer cells increases expression of TM4SF5 and CD44. However, neither overexpression nor knockdown of TM4SF5 affects CD133 expression. As overexpression of CD44 does not change the expression of CD133 and TM4SF5, our results suggest that CD133 regulates TM4SF5 and CD44 as an upstream molecule of them. Then, two tyrosine residues (Y828 and Y852) present in the cytoplasmic tail of CD133 were substituted by a phenylalanine residue individually, or simultaneously, Y828/852F, or the c-terminal cytoplasmic domain of CD133 (52 amino acids) was completely deleted. Under both conditins, c-Src and Akt activities and expression level of TM4SF5 decreased, compared to CD133 wildtype. Topflash reporter assays showed that the transcriptional activity of β-catenin by CD133 mutants decreased, compared to the wildtype. TM4SF5 reporter assays also showed that the activated β-catenin promoted TM4SF5 expression subsequently, suggesting that CD133 regulates TM4SF5 expression by c-Src, Akt, and β-catenin signaling cascades. In 3D aqueous condition, CD133-overexpressing cells formed more and bigger spheres than cells expressing C-terminal mutants of CD133. In addition, treatment of TSAHC, a specific TM4SF5 inhibitor, showed that CD133-overexpressing cells showed more effective inhibitory response to form spheres upon TSAHC treatment, suggesting that CD133 regulates TM4SF5 expression required for sphere formation and growth. Taken together, the expression of TM4SF5 increase by CD133 expression. Tyrosine phosphorylation and activation of c-Src, Akt, and β-catenin signaling pathways triggers liver cancer cells to adopt characteristics of circulating tumor cells.