Effect of maternal dietary protein source on diethylnitrosamine-induced hepatocarcinogenesis in rat offspring

Abstract

모체의 영양상태는 태아의 생애 초기 성장과 발달에 영향을 미치며, 이는 자손의 성인기 만성질환 발병과 밀접한 관련이 있는 것으로 보고되고 있다. 분리대두단백 (SPI)는 카제인 단백질 (CAS)과 달리 이소플라본을 함유하고 있으며, 글리신과 아르기닌의 함량이 높은 반면 메티오닌 함량이 낮은 특성을 가지고 있다. 선행연구에 따르면 모체의 SPI 섭취가 자손의 질병 발병에 미치는 효과는 이소플라본의 효과와 차이가 있다. 본 연구실의 선행연구에서 SPI를 섭취한 어미 쥐로부터 얻어진 생후 3주령의 자손 쥐에서 간 세포의 증식이 활발하게 나타나는 것을 확인하였다. 따라서 본 연구는 이소플라본의 효과가 배제된 SPI의 효과를 살펴보고자 임신 전 2주, 임신기, 수유기 동안에 어미 쥐에게 이소플라본 함량이 적은 SPI를 제공하여 어미 쥐가 섭취한 단백질 급원의 차이가 자손 쥐의 성인기 간암 발생에 미치는 영향을 밝히는데 목적을 두었다. 7주령의 SD종 암컷 쥐를 구입하여 1주간 적응시킨 후 실험식이 종류에 따라 두 군으로 나누어 임신 전 2주, 임신기, 수유기 동안 AIN-93G 기반에 단백질 급원이 CAS 또는 SPI인 식이를 제공하였다. 출산 후 생후 3주령의 수컷 자손 쥐를 어미 쥐로부터 분리시킨 후 chow diet를 공급하고 1주일 간의 적응기를 거쳐 생후 4주째부터 간암유도를 시작하였다. 간암을 유도하는 물질로서 diethylnitrosamine (50 mg/kg body weight) 을 투여 받는 실험군 (DEN group, n = 10)과 0.9% NaCl을 투여 받는 대조군 (CON group, n = 6)으로 나눈 후 주 1회 복강투여를 14주간 수행하였다. 마지막 투여 후 1주일의 유도기를 가진 후 수컷 자손 쥐를 희생시켰으며, 혈액과 간을 적출하여 분석하였다. 본 연구에서 SPI/DEN군은 실험기간 동안 낮은 생존율을 보였으며, 육안상 간 조직을 관찰한 결과 tumor multiplicity가 SPI/DEN군에서 유의적으로 높게 나타났다. H&E염색을 통한 간암 진단에서 역시 CAS/DEN군과 SPI/DEN군이 각각 11.1%와 71.4%의 간암 발생률을 나타내며 유의적인 차이를 보였다. 혈청 gamma-glutamyltransferase와 간 조직 특이적 단백질인 liver-fatty acid binding protein의 측정에서 SPI/DEN군의 간암 발현이 높음을 확인하였으며, 간암의 전이성을 나타내는 matrix metalloproteinase-9의 mRNA발현은 동일한 DEN 처리시 어미 쥐가 SPI식이를 섭취한 경우에만 유의적으로 증가하였다. 세포 증식 지표인 proliferating cell nuclear antigen의 발현은 CAS/DEN군과 SPI/DEN군간에 차이가 없었으나 사멸지표인 cleaved caspase-3 의 경우 SPI/DEN군에서 감소되었다. 이러한 결과들을 종합하여 볼 때 임신기 및 수유기 동안 어미 쥐의 SPI 섭취는 자손 쥐의 간암 발생을 촉진하였을 것으로 사료된다.

Maternal nutrition has been reported to program the offsprings susceptibility to later development of chronic diseases. Because the liver has a major role in coordinating metabolism, changes in liver phenotype may be involved in the development of certain disease in later life. Soy protein isolate (SPI) has isoflavone and low methionine. Previous studies using SPI have mostly focused on the effect of maternal consumption of isoflavone on chronic diseases of adult offspring. Although amino acid composition of SPI is possible to affect the phenotype of the disease, it has not been established that whether the amino acid composition of SPI affects hepatocarcinogenesis in male adult rat offspring. Therefore, we investigated the effect of maternal consumption of a low-isoflavone SPI during pregnancy and lactation on diethylnitrosamine (DEN)-induced hepatocarcinogenesis in male adult rat offspring. Female SD rats were fed purified AIN-93G diets with casein or SPI as the sole protein source for 2 weeks before mating and throughout pregnancy and lactation. At the 3 weeks of age, male offspring were separated from their dams and weaned to a chow-diet throughout the study. From 4 weeks of age, offspring were divided into 4 groups: CAS/CON (offspring rats of dams fed a casein diet received 0.9% NaCl, n = 6)

CAS/DEN (offspring rats of dams fed a casein diet received DEN, n = 10)

SPI/CON (offspring rats of dams fed a SPI diet and received 0.9% NaCl, n = 6)

SPI/DEN (offspring rats of dams fed a casein diet received DEN, n = 10). Injections of DEN at 50 mg/kg body weight were provided once a week for 14 weeks to induce hepatocellular carcinoma (HCC). We observed higher mortality rate and tumor multiplicity compared with the CAS/DEN group. Based on histological examination, HCC incidence was higher in the SPI/DEN group compared with the CAS/DEN group, although we did not find significant differences in histological grade of inflammation, necrosis, steatosis, and fibrosis. In serum analysis, DEN significantly increased aspartate aminotransferase (AST) and alanine aminotransferase (ALT) levels in the SPI group only, but not in the CAS group. As evidenced by a higher serum gamma-glutamyltransferase activity and a lower hepatic liver-fatty acid binding protein level, we confirmed a higher incidence of HCC in the SPI/DEN group relative to CAS/DEN group. The expression of matrix metalloproteinase-9, an important maker reflecting HCC invasion, showed a significant increase in the SPI/DEN group. However, the expression of proliferating cell nuclear antigen, a cell proliferation marker, was not significantly different between the CAS/DEN and SPI/DEN groups. Contrary to this, the SPI/DEN group showed decreased expression of cleaved caspase-3, which indicates decreased cell apoptosis. These results demonstrated that maternal consumption of SPI during pregnancy and lactation promotes DEN-induced HCC in rat offspring.