Surface-enhanced Raman Scattering Active Plasmonic Nanoparticles for Encoding and In Vitro/In Vivo Multiplex Detection

Abstract

바이오 응용 분야에서 다중 분석을 위해선 여러 가지 대상 물질을 동시에 검출하기 위한 다중 신호를 내는 프로브가 필요한데, 이러한 프로브는 신호간 중첩이 적어야 할 뿐만 아니라, 미량의 생체표지자를 대상으로 하여 정량이 가능하고 측정 민감도가 높아야 한다. 현재 가장 많이 사용하고 있는 형광 프로브 및 양자점(Quantum dot)은 신호 대역폭(bandwidth)이 넓어서 여러 신호를 동시에 서로 구별하기 어려울 뿐 아니라, 체내 자가 발광 현상으로 인한 민감도 저하, 별개의 광원을 사용해야 하는 번거로움 등 제한 요소가 다수 존재하게 된다. 최근 다중 분석의 필요성이 강조되면서 다양한 방법이 제안되어 왔는데, 특히 신호 민감도가 뛰어난 것으로 알려진 광신호를 이용한 다중 정량 분석 기술은 아직까지 많은 개발이 이루어지지 않아 주목 받는 기술이라 할 수 있다. 광신호를 이용한 다중 분석 방법 중 라만 산란 신호는 형광에 비해 100배 이상 좁은 신호대역폭을 가지므로 가장 우수한 다중 신호표지 방법으로 인정받고 있으며, 나노 플라즈모닉스를 기반으로 한 표면 증강 라만 산란(SERS, Surface-enhanced Raman Scattering) 신호를 이용하면 형광에 준하는 신호 민감도를 얻을 수 있게 된다. 본 논문에서는 펩타이드 인코딩 및 체내에서 다중 검출을 위한 표면 증강 라만 나노입자들(SERS probe/dot)의 개발 및 표지 방법을 고안하였다. 첫째로 간단하고 효과적인 표면 증강 라만 산란 기반의 펩타이드 인코딩 방법을 개발 하였다. 진단 시약 선도물질을 탐색하기 위해 가장 많이 사용되고 있는 방법에는 레진 비드를 이용한 조합화학 방법이 있으며, 비교적 손쉽게 수백만 종류의 화합물 혹은 펩타이드 등의 라이브러리를 합성하고, 이러한 라이브러리로부터 생물학적 분석을 통해 진단 시약 선도 물질을 발굴해 낸다. 진단 시약 탐색은 매우 많은 수를 대상으로 분석 해야 하기 때문에, 이러한 일련의 작업을 보다 쉽고 빠르게 하기 위해서는 수백만 개의 표적을 효율적으로 표지하고 탐색하는 인코딩 기술이 요구된다. Fmoc 합성법을 이용하여 펩타이드를 텐타젤 비드(35 μm)에 합성하였다. 펩타이드를 합성하는 과정에서 텐타젤 비드에 여러 종류의 신호를 내는 SERS dot을 조합하여 인코딩하였고, 이러한 인코딩은 SERS dot이 마이크로 비드 표면에 물리적인 흡착을 함으로서 이루어 졌다. 마이크로 비드는 2종류의 SERS dot을 조합하여 인코딩 할 경우, 이론적으로 약 10,000 개 이상의 각기 다른 코드를 부여할 수 있다. SERS dot을 이용한 인코딩의 경우의 장점은 다음과 같다. 몇 종류의 라만 표지 화합물부터도 수 많은 수의 코드를 만들 수 있고, 라만 신호의 선 폭이 매우 좁아 신호간의 겹침이 거의 없고, 하나의 레이져 광원으로 여러 종류의 신호를 동시에 읽어낼 수 있다. 둘째로는 약 125 nm 크기의 실리카 나노입자 표면에 수 십 개의 은 나노입자를 도입하고, 이를 금 이온과의 환원력 차이를 이용해 속이 빈 금/은 합금 나노 구조체를 만들었다. 이때 넣어준 금 이온의 양에 따라 점차적으로 속이 빈 구조체가 형성됨을 확인하였고, 속이 빈 나노 구조체가 형성됨에 따라 나노프로브의 최대 흡광 파장이 최초 490 nm 영역에서 최대 840 nm 영역까지 적색 편이(red shift) 하게 되었다. 따라서, 근적외선 영역에서 민감한 나노 프로브는 금 이온 전구체의 양을 조절함으로써 신호의 세기를 최적할 수 있었고, 최적화 된 나노프로브는 근적외선 광원 (785 nm)을 사용하여 SERS 스펙트럼을 측정하였을 경우, 은 나노입자로 구성된 초기 상태와 비교하여 약 4 배 가량의 신호 증가효과가 있었다. 이렇게 제조된 나노프로브는 근적외선 영역의 빛을 사용하였을 때 도입된 분자의 라만 산란신호가 약 10^5 배 증가되었고, 이렇게 증강된 라만 신호로 인해 각각의 개별 나노프로브에서도 라만신호를 검출 할 수 있었다. 이것과는 대조적으로 기존에 주로 사용하던 구형의 금 나노입자(80 nm)에서는 각각의 개별 나노입자 수준에서는 라만 신호를 얻을 수 없었다. 개별 나노프로브의 신호 특성을 살펴보았을 때 개발된 나노프로브는 신호의 세기뿐만 아니라, ensemble average 효과로 인해 신호의 균일성 또한 비교적 우수한 것으로 관측되어 추후 정량적인 분석을 더욱 용이하게 할 수 있는 가능성을 나타내었다. 또한, 개발된 근적외선 민감 나노프로브를 살아있는 실험 쥐에 주입하였고, 라만 측정 장치를 사용하여 실험 쥐의 체내에 존재하는 나노프로브의 신호를 측정하는데 성공하였다. 더 나아가 예시로써 세 가지 종류의 서로 다른 나노 프로브를 생체 내에 동시 주입하여, 각각의 특정 신호가 구별될 수 있음을 보여 줌으로써 다수의 대상 물질에 선택적으로 결합한 각각의 나노 프로브를 동시에 분석해 낼 수 있음을 보였다. 마지막으로 은 나노쉘 기반의 근적외선 라만 표지 나노입자를 개발하였다. 실리카나노 중심입자와 은나노 껍질 구조로 이루어져 있는 은 나노쉘은 우수한 라만 증강 효과와 가시광영역에서 근적외선 영역까지 표면 플라즈몬 파장이 쉽게 변조될 수 있기 때문에 현재 많은 주목을 받고 있다. 하지만 현재까지 알려진 은 나노쉘을 만드는 방법은 상대적으로 복잡한 합성과정이 문제가 되어왔다. 본 논문에서는 은 나노쉘기반의 근적외선에서 민감한 표면증강라만 산란 나노입자를 복잡한 과정이나, 금속 씨앗이 없이 만드는 방법을 고안하였다. 제조된 은 나노쉘표면은 울퉁불퉁한 모양으로 실리카 표면을 완전히 덥고 있었으며, 은 나노쉘의 두께는 약 32 nm에서 76 nm까지 쉽게 조절 가능하였다. 은나노쉘 기반의 근적외선 민감 표면 증강 라만 산란 나노입자는 우수한 라만 신호세기를 나타내었고, 증강 인수는 6.4×10^5 이었다. 또한, 이 나노 프로브를 세포 내로 흡입시키고, 이를 살아 있는 쥐의 조직에 주입하고, 추적한 결과 살아있는 쥐의 생체조직 내에서도 3일 가량 추적이 가능함을 보였다.

SERS (surface-enhanced Raman scattering) technology has broadened the applications of Raman spectroscopy in biomedical analysis field. Recently, we have developed SERS active nanoparticles (SERS probe/dot), which have many advantages

a lack of photo-bleaching, narrow band width and a use of single laser excitation for detection of multiple targets. They were successfully utilized in peptide encoding and identifying biological molecules in vivo system. In chaper 1, simple and efficient surface-enhanced Raman scattering (SERS) based encoding method for high-throughput screening (HTS) system was discribed. Recently, the preparation and screening of compound libraries remain one of the most challenging tasks in drug discovery, biomarker detection, and biomolecular profiling processes. So far, several distinct encoding/decoding methods such as chemical encoding, graphical encoding, and optical encoding have been reported to identify active compounds from those libraries. Peptides were synthesized on TentaGel (TG) microbead (35 μm) by using Fmoc chemistry. During peptide coupling, the TG microbeads were encoded by the combination of several kinds of SERS dots, which are physically adsorbed on the microbead surface. When the microbead was encoded by the combination of 2 kinds of the SERS dots, more than 10,000 codes can be generated. The advantages of this SERS dots based encoding method lies in the availability of a large number of Ramam active molecules which can be utilized as Raman label compounds. Moreover, a single excitation is used for the detection of multiple encodings. In chapter 2, near-IR (NIR)-sensitive Plasmonic Au/Ag hollow-shell (HS) assemblies on the surface of silica nanospheres were described. The diameter of the HS interior was adjusted from 3 to 11 nm by varying the amount of Au(3+) added, which resulted in a red-shift of their plasmonic extinction of Ag/Au nanoparticle toward the NIR window (700–900 nm). The red-shifted plasmonic extinction of NIR SERS dots caused enhanced SERS signals in the NIR optical window where endogenous tissue absorption coefficients are more than two orders of magnitude lower than those for ultra-violet and visible light. In particular, a single NIR SERS dot could be detected with high reproducibility owing to approximately 3×10^5 times SERS enhancement on average and a large number of SERS-active sites on single silica nanosphere. The signals from NIR SERS dots were detectable effectively from 8-mm depth in animal tissues. Three kinds of NIR SERS dots, which were injected into live animal tissues, produced strong SERS signals from deep tissues without spectral overlap, demonstrating their potential for in vivo multiplex detection of specific target molecules. In chapter 3, silver nanoshell based NIR SERS nanoprobes were described. Silver nanoshells (AgNSs) composed of a dielectric core and a silver shell are of great interest due to excellent SERS sensitivity, and to their tunable surface plasmon frequencies in the NIR spectral region, so called biological window (700-900 nm). Previous synthetic approaches to AgNS have not been satisfactory for the effective synthesis under mild conditions. Here, we first report a seedless and single-step synthetic method for bumpy AgNSs, and AgNS based NIR-sensitive SERS nanoprobes. The bumpy AgNSs were fabricated in fully extended form without using seed metals under a mild condition (1h, 25 oC) and the silver shell thickness could be easily controlled in the range of ~32 nm to ~76 nm. In particular, the NIR-SER probes, bumpy AgNSs coded with simple aromatic compounds, were capable of generating strong SERS signal from a single particle level in the NIR window (average SERS enhancement factor value 6.4 ×10^5). In addition, NIR-SERS probes were successfully applied to cell tracking in living animals using a portable Raman system.