Biomimetic application of phosphatidylserine and PEGylated phosphatidylserine for macrophage polarization

Abstract

1. 연구목적<br/> 세포막의 주성분인 포스파티딜세린은 대식세포의 인식 및 제거 등과 관련되며 염증반응에서도 중요한 역할을 한다. 본 연구에서는 포스파티딜세린 리포좀의 효과를 지속시키고, 대식세포의 분극을 조절하기 위해 폴리에틸렌글리콜을 적용하였다. 또한 치과 용 임플란트의 새로운 코팅법으로 포스파티딜세린 리포좀을 티타늄 표면에 적용하여 생체모사 지지형 지질 이중층이 생성되도록 하였다.<br/> <br/> 2. 연구방법 <br/> 포스파티딜세린 리포좀 (포스파티딜세린:포스파티딜콜린:콜레스테롤 = 2:1:1 몰비)은 소형 압출기와 폴리카보네이터 필터 (50, 100, 200 및 400 nm 구멍)를 사용하여 제조하였고. 폴리에틸렌글리콜화된 포스파티딜세린은 DSPE-PEG-2000을 상이한 농도 (0.25%, 0.5% 및 1%)로 첨가한 것을 제외하고는 동일한 방법으로 제조하였다. RAW 264.7 세포를 사용하여 염증 관련 사이토카인 TNF-α 및 TGF-β의 발현에 대한 폴리에틸렌글리콜화된 포스파티딜세린의 효과를 평가하였다. TRITC-DHPE로 표식된 포스파티딜세린 리포좀의 세포 내로혼입되는 것은 형광표지세포분획 (FACS) 및 형광현미경으로 평가하였다. 다양한 백분율 (10%, 20%, 40%, 50% 및 60%)의 포스파티딜세린을 함유한 포스파티딜세린과 포스파티딜콜린으로 구성된 지지형 지질 이중층을 칼슘 완충액을 이용하여 리포좀 융합법으로 티타늄 표면에 적용하였다. 티타늄 표면에서 지지형 지질 이중층의 유동성은 광표백 이미징 후 형광 복구 (FRAP)를 사용하여 분석하였다. 티타늄 표면에서의 RAW 264.7 세포의 형태는 전자현미경 (SEM)으로 관찰하였고, 세포 부착 및 증식을 추가 분석 하였다. 또한, M2 대식세포 분화는 실시간 유전자 중합효소 연쇄반응 (real time RT-PCR) 및 M2 특정 마커를 이용한 면역형광분석 (IF)으로 분석되었다.<br/> <br/> 3. 연구결과<br/> 100 nm 크기의 포스파티딜세린 리포좀이 12.5 μg/mL의 농도에서 염증 관련 사이토카인 발현 조절에 가장 큰 영향을 미쳤다. 폴리에틸렌글리콜화는 TNF-α및 TGF-β 발현에 차별적으로 영향을 미쳤다. TNF-α 분비에 대한 포스파티딜세린 리포좀의 억제 효과는 폴리에틸렌글리콜화에 의해 강화되었으며, 폴리에틸렌글리콜화된 포스파티딜세린 리포좀은 단순 포스파티딜세린 리포좀에 비해 TGF-β 수준을 감소시켰다. FACS 분석 결과 1% 폴리에틸렌글리콜화가 포스파티딜세린 리포좀이 대식세포로의 혼입을 방해하는 것으로 나타냈다. 또한 형광이미지는 포스파티딜세린 리포좀과 RAW 264.7 세포 사이의 상호 작용이 폴리에틸렌글리콜화에 의해 영향을 받는다는 것을 증명했다.<br/> FRAP 이미지 분석 결과 포스파티딜세린 비율이 지지형 지질 이중층의 유동성에 결정적인 영향을 주는 것을 알 수 있고, 20%는 높은 유동성의 지지형 지질 이중층을 얻기 위한 최적의 농도라고 제시할 수 있다. 20% 포스파티딜세린 군에서 더 많은 세포가 부착되었으며 (p<0.05), 지지형 지질 이중층으로 코팅된 티타늄 디스크에서 배양된 세포는 코팅하지 않은 디스크 위에서 보다 더 길고 넓게 펴진 형태를 나타냈다. 특히 20% 포스파티딜세린 군에서 그러한 경향이 두드러지게 나타났다. 두 성장 인자 (염증을 억제하는 TGF-β와 VEGF)의 유전자 발현 수준은 코팅하지 않은 대조군에 비해 20% 포스파티딜세린 군에서 현저하게 증가 하였다 (p<0.05). 포스파티딜세린을 함유한 지지형 지질 이중층 코팅은 대식세포의 M2-분극을 유도하였고, 면역형광이미지에서CD206 양성을 보였다.<br/> <br/> 4. 결론<br/> 폴리에틸렌글리콜화된 포스파티딜세린 리포좀은 TGF-β 수치를 증가시키지 않는 동시에 TNF-α 분비를 예방할 수 있는 것으로 보여 치주염 및 임프란트 주위염에서 조직 섬유화를 상대적으로 감소시키는 항염증제로 사용될 수 있을 것으로 기대된다. 포스파티딜세린을 함유한 지지형 지질 이중층 코팅은 대식세포의 M2 분극을 유도 할 수 있으며, 염증을 줄이고 상처 치유를 촉진할 수 있다. 이러한 결과로 치과용 임플란트에서 지지형 지질 이중층 코팅의 사용 가능성을 제시할 수 있다. <br/> <br/> 주요어: 포스파티딜세린, 리포좀, 폴리에틸렌글리콜, 지지형 지질 이중층, 대식세포, 분극.