A Genetic Analysis of the two potential BIN2 Interactors At5g62970 & At5g56690

Abstract

유비퀴틴화(ubiquitination)은 세포에서 단백질을 제거하기 위해 사용되는 기작이며, 애기장대에서 브라시노스테로이드(BR)의 합성 및 기능은 수년간의 연구로 상세하게 밝혀져 있으며 BR은 수용체를 따라 최종적으로 BIN2 단백질을 유비퀴틴화하여 분해함으로서 유전자에 직접적 반응을 이끌어 낸다고 알려져 있다. BIN2는 SCF 복합체를 이루는 것으로 알려져 있으며 따라서 F-Box 단백질이 목표 단백질(BIN2)와 결합하여 유비퀴틴화를 진행한다.

F-Box 단백질을 확인하기 위해 선행연구를 통해 확인이 된 두 유전자 후보 At5g62970과 At5g56690를 대상으로 하여 본 수행자는 Gateway System을 사용하여 클로닝을 진행하였고 야생형 Col-0와 Pro35S:BIN2 형질전환체에 각각 삽입하고, 표현형을 관찰하였다. 표현형이 야생형과 비슷하게 회복 된 경우도 있었으나 많이 회복되지 않은 표현형도 나타났다. 다수는 BIN2 과발현체보다 회복되는 표현형을 보임으로서 과발현시킨 At5g62970이 BIN2와 관련 된 역할을 하는 것으로 추측해 볼 수 있었다. Col-0를 백그라운드로 형질전환 한 경우에는 성체의 크기가 약간 크고 성장 속도가 빨랐다. 이후 RNA를 통하여 BR의 생합성과 신호전달 마커 유전자들을 확인해 본 결과 생합성에 영향을 주는 유전자들은 크게 변하지 않는 반면 신호전달에 관련 된 유전자는 차이를 보이는 것을 통해 신호전달경로에서 At5g62970이 영향이 있음을 확인할 수 있었다. 형질전환체는 BL에 더 민감하게 반응하여 뿌리의 길이에 영향을 받았지만 생합성 저해제인 Pcz를 처리한 결과, 야생형에 비해 회복될 것이라 예측하던 뿌리길이가 야생형에 비해 짧아진 것을 통해 형질전환체가 BIN2를 지속적으로 제거함으로서 신호전달을 활성화 시키고 있는 것은 아닌 것으로 확인되었다.

과발현체에서 Pro35S:BIN2 에 대한 표현형 회복이 나타나는 부분에 있어 At5g62970이 BIN2의 발현량과 관련이 있다고 추측할 수 있다. 하지만 표현형이 나타나지 않은 것을 통해 BIN2에 결합하는 E3 ligase가 한 종류가 아니며, At5g62970이 기능을 하지 않더라도 결합하는 다른 E3 ligase가 있을 수 있음을 유추할 수 있었다. 주요경로로 작용하는 E3 ligase와 일시적이거나 약하게 결합하는 경로가 있을 것이라고 추측

Ubiquitination is the mechanism used to remove proteins from cells, and plays a very important role in protein synthesis, function, and degradation. In Arabidopsis, brassinosteroid (BR) signaling leads to a direct gene response by ubiquitinating the BIN2 protein along with the receptor. BIN2 is known to be a constituent of the Skp, Cullin, F-box containing (SCF) complex, and thus the F-box E3 Ligase protein binds to the target protein (BIN2) to carry out ubiquitination.

To confirm the role of the F-box protein in the BIN2 degradation process, we cloned two candidate genes: At5g62970 and At5g56690, which were confirmed by previous in vitro pull-down assay. The two candidate genes were cloned into an overexpression vector and transformed into the wild-type Col-0 and Pro35S:BIN2 transgenic lines. Selected plant individuals had a recovered mutant phenotype similar to wild types, but the phenotype was not consistent. In confirming biosynthesis and the expression of BR signaling marker genes through RT-PCR, the genes affecting biosynthesis did not change much, but the genes involved in the signaling pathway did change, confirming the effect of At5g62970. After treatment with the brassinosteroid biosynthesis inhibitor propiconazole, we confirmed that Col-0/Pro35S:At5g62970 did not activate signal transduction by continuously removing BIN2.

It can be inferred that At5g62970 is related to BIN2 expression because phenotype recovery of Pro35S:BIN2 occurred in Pro35S:BIN2/Pro35S:At5g62970. However, no significant phenotype changes were observed in some Pro35S:BIN2/Pro35S:At5g62970 individual plants, although these individuals expressed the At5g62970-FLAG protein. This implies that the At5g62970 is not the only E3 ligase to bind to BIN2

it can be assumed that there is another E3 ligase which binds to BIN2 when At5g62970 does not function. Recently, it has been reported that the gene, KIB1, functions as an E3 ligase of BIN2, suggesting that there are many E3 ligases of BIN2. At5g62970 is suspected to be a transient or weak-binding E3 ligase in BIN2 degradation, which acts as a minor pathway.