Effects of murein lipoprotein (Lpp) on virulence of Cronobacter sakazakii ATCC 29544

Abstract

Cronobacter sakazakii (크로노박터 사카자키)는 괴사성 장염, 패혈증, 뇌수막염과 같은 질병을 유발하는 식중독균으로, 특히 영유아에게 있어 높은 치사율을 나타낸다. 치명적인 병원성에도 불구하고, C. sakazakii의 병원성과 관련된 메커니즘과 그 인자들에 대한 연구는 아직 미비한 실정이다. 따라서 C. sakazakii의 기준주인 C. sakazakii ATCC 29544 균주를 이용하여, 병원성과 관련된 새로운 인자를 규명하고자 하였다. 본 연구에서는 선행 연구에 의해서 스크리닝 된 인자들 중, C. sakazakii의 외막 단백질 중 하나인 murein lipoprotein (Lpp)을 타깃으로 선정하였으며, Lpp의 C. sakazakii 내 병원성 관련 역할을 규명하였다. lpp 유전자의 역할을 규명하기 위하여, Lambda-red recombination 방법으로 구축된lpp 유전자가 결여된 균주를 이용하여, phenotype을 확인, 비교하는 실험을 진행하였다. lpp 유전자가 결여된 균주는 Cell membrane permeability assay 결과에서, membrane integrity가 다소 감소하는 결과를 보였다. 또한, lpp 결여 균주는 0.3% 한천 배지에서 wild type 보다 더 높은 운동성을 보였으며, 편모 합성 관련 유전자의 전사체 발현 정도가 증가하였다. TEM 관찰 결과, 편모의 수가 wild type과 비교하여 증가하였음을 확인할 수 있었다. lpp 결여 균주를 이용하여 인간 유래 장 상피 세포인 Caco-2로의 침투와 부착 능력을 확인해본 결과, 모두 현저하게 감소하였다. 뿐만 아니라, 대식 세포인 RAW 264.7 내의 생존 능력도 wild type과 비교하였을 때 크게 떨어지는 것을 확인하였다. 특히, EGTA를 이용하여 tight junction이 제거되어도, lpp 결여 균주의 Caco-2 내로의 침투 능력이 wild type 만큼 증가하지 않았다. 이는 C. sakazakii 의 Lpp가 세포 기저부로의 침투에 있어 중요한 역할을 함을 의미한다. 또한, 정제한recombinant Lpp 단백질을 wild type과 함께 처리하였을 때에, 농도 의존적으로 Caco-2로의 부착 능력이 감소하는 것을 확인하였다. 이를 통해, Lpp 단백질이 숙주 세포 표면의 어떤 부분에 부착한다는 것을 알 수 있으며, adhesin으로서의 역할을 함을 나타낸다. 결론적으로, 본 연구 결과는 Lpp가 C. sakazakii ATCC 29544의 병원성에 중요한 역할을 한다는 것을 의미한다.

Cronobacter sakazakii is a foodborne pathogen that causes necrotizing enterocolitis and sepsis with a high mortality particularly in neonates. Since very little is known about the mechanisms of its pathogenicity. Identifying virulence determinants of the pathogen is of high priority. Screening of outer membrane proteins in C. sakazakii was conducted to identify new virulence factors and murein lipoprotein, encoded by lpp gene, was studied here. To examine the role of lpp in C. sakazakii virulence, lpp mutant was constructed using Lambda-Red recombination and its phenotypes were characterized. Cell membrane permeability assays showed that the membrane integrity is altered by the lpp mutation. In addition, the lpp mutant exhibited hyper-motility on 0.3% soft agar and higher expression level of flagellar biosynthesis genes. Consistent with this, lpp mutant cells were hyper-flagellated observed by transmission electron microscopy. Importantly, the absence of lpp in C. sakazakii decreased invasion (by at least 3 folds) and adhesion ability (by at least 4 folds) toward Caco-2 human intestinal epithelial cells, respectively, as well as reduced survival within RAW 264.7 murine macrophages compared with wild type. The invasiveness of the mutant was not increased as that of the wild type in tight junction-disrupted Caco-2 cells generated by EGTA treatment, indicating that lpp is involved in the basolateral invasion of C. sakazakii. Furthermore, the extracellular provision of purified recombinant Lpp decreased the adhesion ability of C. sakazakii toward the Caco-2 cells in a dose-dependent manner, suggesting that Lpp may function as a new adhesin binding to unknown receptor present on the surface of the host cells. These results suggest that lpp has crucial roles in the virulence of C. sakazakii.