Optimizing Tissue Clearing and Imaging Method for Human Brain Tissue: Preparing Methods, Clearing Efficiency, Staining Methods, and Imaging Strategy

Abstract

Currently, the tissue clearing method is actively used in neuroscience research. Recent advances in tissue clearing method allow visualization of neural networks inside the unsectioned whole brain tissues. However, a protocol applicable for human brain tissue has not yet been established. Our goal is to optimize human brain clearing and imaging methods using fresh human samples. Two types of human brain samples were used: Fresh samples and cadaver samples. Fresh samples were obtained at autopsy and fixed for about one week. Cadaver samples were obtained for medical education and research and fixed about two years post mortem. Active electrophoretic clearing was used for human brain tissue. The degree of transparency, artifacts (causing auto fluorescence and scatter phenomenon) and quantity of DAPI staining were quantified using Image J. DAPI (Nucleus), Lectin (Blood vessel) and GFAP (Astrocyte) were stained for 4 days (4DP), 11 days (11DP) in PBS. Commercial staining kit (DeepLabel staining kit, 4DP-C) and staining method which is using the electrophoresis device (perfectSTAIN, 1DA) were used to human brain tissue. The staining efficiency of various staining strategy was compared (staining time, antibody penetration depth, complexity of the staining method, degree of tissue contamination and cost). Confocal microscope was used to investigate staining depth. Fresh samples showed higher clearing efficiency compared to cadaver samples (time required for 80% transparent

4 hr vs. 40 hr). Fresh samples showed fewer artifacts compared to cadaver samples. Regarding the antibody staining efficiency, fresh and cadaver samples showed similar penetration depth (about 65um). In fresh samples, DAPI was stained over 500μm in depth after 16hrs of incubation. The DAPI fluorescent brightness of the surface was increased in accordance to the incubating duration. Samples showed deeper GFAP staining depth when they were incubated longer in PBS buffered antibody solution. In the results of antibody penetration depth, 11DP showed a trend of deeper staining compared with 4DP (4DP: 65um vs 11DP: 125um). Furthermore, 4DP-C showed significantly deeper staining compared with 4DP (P=0.006) (4DP: 65um vs. 11DP: 125um vs. 4DP-C: 160um). Although statistically not significant (n=1), the using electrophoresis device showed highest efficiency. In conclusion, we have successfully visualized human brain 3D microstructure with optimized clearing and staining methods. The present study provided and compared various cleared specific and protocols for human brain clearing and staining. The most optimized human brain clearing method of the present study will open new paradigm for disease diagnosis and human brain research.

오늘날, 조직 투명화 기법은 신경과학연구에 널리 사용되고 있다. 근래에는 조직 투명화 기법을 사용하여 설치류 전체 뇌의 신경 연결까지 확인할 수 있을 만큼 기술이 발달했다. 하지만 사람 뇌에 조직 투명화 기법을 적용한 예는 많지 않기 때문에 사람 뇌 연구를 위한 최적화된 조직 투명화 및 염색 방법이 없다. 이 논문에서는 사람 뇌 연구에 사용할 수 있는 최적화 된 조직 투명화 기법과 면역 염색 방법을 제안하고자 하였다. 본 연구진은 두 종류의 사람 뇌 샘플을 사용하여 연구를 진행하였다. 첫번째로는 부검 시에 얻을 수 있는 신선한 뇌 샘플이고, 두번째로는 의과대학에 교육 및 연구용으로 기증된 뇌 샘플이다. 연구용 기증 뇌 샘플의 경우 약 2년간 고정되었고, 신선한 뇌 샘플의 경우 약 일주일간 고정되었다. 이 연구에서는 전기 영동 장치를 사용한 조직 투명화 기법을 위의 두 샘플에 적용하고, 시간에 따른 투명화 정도, 이미징 시 발생하는 artifacts, 핵 염색의 밝기 정도를 Image J로 정량화 하였다. 염색은 사람 뇌 조직을 4일, 11일 동안 항체와 화학 염색약을 희석한 PBS에 담그는 방식으로 진행되었다. 또한 시중에 판매하는 염색 키트와 전기 장치를 사용한 염색 방법을 도입하였다. 각 염색 방법은 염색 시간, 항체 침투 깊이, 염색 방법의 난이도, 조직 오염도와 비용의 항목에서 비교 되었다. 모든 이미징은 공초점 현미경을 사용했다. 신선한 뇌 샘플은 연구용 기증 뇌 샘플에 비해 투명화 효율이 높았다. 80%가량 투명화 되는 데에 신선한 뇌 샘플은 4시간, 연구용 기증 뇌 샘플은 40시간이 소요됐다. 또한 신선한 뇌 샘플은 연구용 기증 뇌 샘플에 비해 더 적은 artifacts를 보였다. 항체 염색에 관해서는 신선한 뇌 샘플과 연구용 기능 뇌 샘플이 비슷한 항체 침투 깊이를 보였다. 신선한 뇌 샘플을 사용하여 핵 염색을 했을 때 16시간 이상 담가두면 500um깊이까지 염색 되었고, 표면 밝기도 강해졌다. 여러 염색 방법을 비교한 결과 4일동안 염색한 샘플은 11일동안 염색한 샘플보다 항체 침투 깊이가 얕았다. 또한 11일 동안 염색한 샘플보다 시판되는 염색 키트를 사용했을 때 항체 침투 깊이가 깊었다. 그리고 통계적인 비교는 불가능했지만 (n=1) 시판되는 염색 키트보다는 전기 장치를 사용한 염색 방법이 항체 침투 깊이가 깊었다. 본 연구는 성공적으로 사람의 3차원 뇌 구조를 보여주었다. 사람 뇌 샘플을 3차원으로 이미징 하기 위해서는 신선한 뇌 샘플을 사용하고, 시판하는 염색 키트를 사용하는 것이 가장 최적화된 방법이다. 만약 특수 기기 사용이 가능하다면 전기 장치를 사용한 염색 방법도 시도해볼 가치가 있을 것 같다. 결론적으로 본 연구는 사람 뇌 연구에서 사용할 수 있는 최적화 된 조직 투명화 기법과 염색 방법을 제안하였고, 추후 질병 진단이나 사람 뇌 연구에 적용 가능한 새로운 패러다임이 될 것이다.