Regulation of IL-24 by Tannerella forsythia in oral keratinocytes

Abstract

1. 목 적 인터루킨 -24 (IL-24)는 인터루킨 -10 계열의 구성원으로 IL-24 수용체 (IL-20R2 / IL-20R1 및 IL-20R2 / IL-22R1)와 결합한다. 동일한 수용체를 공유하는 사이토카인인 IL-19 및 IL-20과 달리, IL-24는 당화되어서 생물학적 활성을 가질 수 있다. IL-24는 염증성 장 질환 (IBD), 건선, 류마티스 관절염 (RA) 및 각막염과 같은 염증성 질환에서 고도로 발현되었다. Tannerella forsythia는 그람 음성균이며 치주 질환의 원인균으로 알려져 있다. 이전의 프로테옴 연구에서 T. forsythia가 48 시간 감염 후 사람 구강 각화 세포 (HOK-16B 세포)에서 IL-24를 유의하게 증가시키는 것으로 나타났다. T. forsythia의 몇 가지 독성 인자와 그 경로 기전이 연구되었지만 IL-24에 대한 연구는 아직 이루어지지 않았다. 본 연구의 목적은 T. forsythia에 의한 HOK-16B 세포의 IL-24 유도와 관련된 인자들과 염증성 인자의 발현에 미치는 IL-24의 영향을 조사하는 것이다

2. 방 법 HOK-16B 세포를 T. forsythia 및 Streptococcus oralis (S. oralis)로 12 내지 48 시간 동안 다양한 MOI (0, 100, 500)에서 처리 하였다. IL-24의 mRNA 수준은 실시간 중합효소연쇄반응으로, 단백질 수준은 면역블로팅으로 분석하였다. IL-24 생산에 활성산소종 (reactive oxygen species, ROS)이 관련되는지 알아보기 위해 T. forsythia의 ROS 생성을 2',7'- 디클로로플루오레신 디아세테이트 (DCF-DA)을 사용하여 측정하 였고 ROS에 의한 IL-24 발현 및 당화 조절은 ROS 억제제인 N-아세틸시스테인 (NAC)을 사용하여 평가하였다. 사이토카인 및 MAPK 신호 전달 경로에 의한 IL-24의 조절을 분석하기 위해 염증성 사이토 카인인 IL-6 및 TNF-α와 MAPK 억제제를 HOK-16B 세포에 처리한 후 IL-24의 발현을 실시간 중합효소연쇄반응 및 면역 블로팅으로 분석하였다. IL-24가 염증 유발 인자를 유도 할 수 있는지 알아보기 위해 HOK-16B 세포를 재조합 IL-24로 처리하여 IL-1α, IL-8, CXCL10 및 MCP-1의 발현을 실시간 중합효소연쇄반응으로 분석하였다.

3. 연구결과 T. forsythia는 HOK-16B 세포에서 IL-24 발현을 유도하고 배양 상등액으로 당화된 IL-24를 분비하였으나 S. oralis에 의해서는 이러한 현상이 일어나지 않았다. T. forsythia는 HOK-16B 세포에서 ERK 및 p38을 활성화 시켰으며, 이들의 활성화를 억제했을 때 IL-24의 발현 감소 및 당화된 IL-24의 분비가 감소했다. T. forsythia는 HOK-16B 세포에서 ROS 생성과 IL-6 발현을 증가시켰다. IL-6는 IL-24 발현 및 당화의 강력한 유도제였다. IL-24의 발현과 당화는 ROS 억제제인 NAC와, ERK와 p38의 억제제를 처리했을 때 감소하였다. 재조합 단백질 IL-24를 HOK-16B 세포에 처리했을 때 IL-1α, IL-8, CXCL10 및 MCP-1의 발현이 유의하게 증가한 반면 IL-6 발현에는 영향을 주지 않았다.

4. 결 론 당화된 IL-24는 HOK-16B 세포에서 T. forsythia에 의해 유도되었으며 ROS와 MAPK 활성화를 통해 유도된 IL-6에 의해 조절되었다. IL-24는 전염증성 인자를 증가시켰으며 이 결과는 T. forsythia에 의해 유도 된 IL-24가 치주 병인과 관련이 있음을 시사한다.

Objectives Interleukin-24 (IL-24) is a member of the interleukin-10 family and binds to the IL-24 receptors (IL-20R2/IL-20R1 and IL-20R2/IL-22R1). Unlike IL-19 and IL-20, which are cytokines that share the same receptors, IL-24 can be glycosylated to be biologically active. IL-24 was highly expressed in inflammatory diseases such as inflammatory bowel disease (IBD), psoriasis, rheumatoid arthritis (RA) and keratitis. Tannerella forsythia is a gram-negative bacteria and is known to be a causative agent of periodontal disease. Our preliminary proteomic study showed that T. forsythia significantly increased IL-24 in human oral keratinocytes (HOK-16B cells) after 48 h incubation. Several virulence factors and their pathogenic mechanisms of T. forsythia have been studied, but no studies have been conducted on IL-24. The objective of this study was to examine the factors involved in the induction of IL-24 in HOK-16B cells by T. forsythia and the effect of IL-24 on the expression of pro-inflammatory factors.

Methods HOK-16B cells were treated with T. forsythia and Streptococcus oralis (S. oralis) at various MOIs (0, 100, 500) for 12 to 48 hr. The mRNA level of IL-24 was measured by real-time RT-PCR and the protein level was measured by immunoblotting. To determine whether reactive oxygen species (ROS) was associated with IL-24 production, ROS generation by T. forsythia was measured using 2,7-dichlorofluorescin diacetate (DCF-DA) and the regulation of IL-24 expression and glycosylation by ROS were evaluated by using a ROS inhibitor N-acetylcysteine (NAC). To analyze the regulation of IL-24 by cytokines and MAPKs signaling pathway, IL-6 and TNF-α, which are inflammatory cytokines, and MAPKs inhibitors were added into HOK-16B cells and the expression of IL-24 was analyzed by real-time RT-PCR and immunoblotting. To assess whether IL-24 can induce pro-inflammatory factors, HOK-16B cells were treated with recombinant IL-24 and the expression of IL-1α, IL-8, CXCL10, and MCP-1 was analyzed by real-time RT-PCR.

Results T. forsythia induced the expression of IL-24 in HOK-16B cells and secretion of glycosylated IL-24 into the culture supernatants, but S. oralis did not. T. forsythia activated ERK and p38 in HOK-16B cells and inhibition of ERK and p38 activation resulted in reduced expression of IL-24 and secretion of glycosylated IL-24. T. forsythia increased the level of ROS and IL-6 expression in HOK-16B cells. IL-6 was a strong inducer of IL-24 expression and glycosylation. IL-24 expression and glycosylation were decreased when treated with NAC, an ROS inhibitor, and inhibitors of p38 and ERK. Recombinant IL-24 induced IL-1α, IL-8, CXCL10, and MCP-1 in HOK-16B cells, but not IL-6.

Conclusion In this study, glycosylated IL-24 was induced by T. forsythia in HOK-16B cells and it was regulated by IL-6 via ROS and MAPK activation. IL-24 was able to increase pro-inflammatory factors. These results indicate that T. forsythia-induced IL-24 may be involved in periodontal pathogenesis.