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Engineering of bacteriophage endolysins and their applications to control and detect foodborne pathogens : 식중독균의 제어 및 검출을 위한 박테리오파지 엔도라이신의 엔지니어링 및 응용에 관한 연구

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Authors

손보경

Advisor
유상열
Major
농업생명과학대학 농생명공학부
Issue Date
2019-02
Publisher
서울대학교 대학원
Description
학위논문 (박사)-- 서울대학교 대학원 : 농업생명과학대학 농생명공학부, 2019. 2. 유상열.
Abstract
As the incidence of antibiotic-resistant bacteria has become increased, phage endolysins have received considerable attention as one of the promising alternatives to antibiotics. However, the discovery of potent endolysin is challenging because it requires labor-intensive work and has difficulties in getting soluble form with high lytic activity. In this respect, modular structure of endolysin consisted of enzymatic active domain (EAD) and cell wall binding domain (CBD) provides an opportunity to develop novel endolysins by rearrangement or random mutagenesis of domains. Most staphylococcal phage endolysins consist of an N-terminal cysteine, histidine-dependent amidohydrolases/peptidase (CHAP) domain, a central amidase domain, and a CBD. Despite extensive studies using truncated staphylococcal endolysins, the precise function of the each domain, especially amidase domain, has not been determined. Understanding an exact function of each domain is the most important factor to be considered for successful modular engineering of endolysins. For these reasons, a functional analysis of each domain of endolysins from S. aureus phage was performed. I found that the CHAP domain conferred the main catalytic activity of the endolysin, while the central amidase domain showed no enzymatic activity in degrading the intact S. aureus cell wall. However, the endolysins lacking the amidase domain had reduced hydrolytic activity compared to the full-length endolysins. The comparison of cell wall binding affinity of a CBD and an amidase plus CBD fused with a green fluorescent protein revealed that the major function of the amidase domain is to enhance the cell wall binding affinity of CBD, leading to the maximal lytic activity of endolysin. These results suggest an auxiliary role of the amidase domain of staphylococcal endolysins in cell wall binding, and can be useful information for designing effective antimicrobial and diagnostic agents against S. aureus. Based on these results, a random domain swapping of S. aureus endolysins was conducted to obtain the engineered endolysins with higher lytic activity than their parental endolysins. In random libraries, the novel chimeric endolysin, Lys109 which consists of a LysSA12 CHAP domain, a LysSA97 amidase domain and a LysSA97 CBD was selected and characterized for its staphylolytic activity. Lys109 exhibited bacterial cell lysis activity higher than its parental endolysins against Staphylococcus species. In addition, the staphylococcal biofilm was effectively removed by the treatment of Lys109. The bactericidal activity of Lys109 was evaluated in foods and on stainless steel. In milk, S. aureus was completely destroyed within 45 min when treated with 900 nM of Lys109. The treatment of 50 nM Lys109 on the surface of pork and beef for 1 h resulted in 3-log/cm2 and 2-log/cm2 reduction of S. aureus cells, respectively. A complete bacterial elimination was observed after 1 h treatment with 100 nM of Lys109 on the stainless steel. These results propose that a novel chimeric endolysin with higher activity and solubility can be developed by a random domain swapping of endolysins and that the chimeric endolysin has a great potential as an antimicrobial agent. Next, I constructed fusion proteins consisting of two different endolysins to test their activity and stability for simultaneous control of S. aureus and B. cereus. This is the first study to generate fusion proteins with two endolysins targeting different bacterial genus. The full-length or C-terminally truncated LysB4 (LysB4EAD), an endolysin from B. cereus-infecting phage B4, were fused to LysSA11, an endolysin of S. aureus-infecting phage SA11, via a helical linker in both orientation. The fusion proteins maintained the lytic activity of their parental endolysins against both S. aureus and B. cereus, showing successfully extended antimicrobial spectrum. Among them, LysB4EAD-LysSA11 showed significantly increased thermal stability compared with its parental endolysins and was selected for further study. LysB4EAD-LysSA11 showed high lytic activity at pH 8.0-9.0 against S. aureus and at pH 5.0-10.0 against B. cereus, but the lytic activity of the protein was decreased in the presence of 50 mM NaCl. The strong lytic activity of LysB4EAD-LysSA11 was also observed in boiled rice contaminated with S. aureus and B. cereus. In addition, the treatment of LysB4EAD-LysSA11 in the contaminated boiled rice showed the same or higher lytic activity against S. aureus and B. cereus compared to that of two parental endolysins. These results indicate that LysB4EAD-LysSA11 can be used as an effective antimicrobial agent targeting multiple pathogens. This study will be helpful to design highly specific but multifunctional antimicrobials. Lastly, CBD of LysPBC1 from Bacillus cereus-infecting phage PBC1 was engineered by a phage display technique to enhance its cell wall binding affinity. LysPBC1_CBD was successfully displayed on the M13 filamentous phage via pIII coat protein and the displayed protein retained its binding ability to B. cereus. A random mutation library of LysPBC1_CBD on phage was constructed and selected for better binding to B. cereus cells. Among the 10 clones selected from the library, a LysPBC1_CBD Q47H mutant showed approximately 2-fold increase in cell wall binding ability compared to LysPBC1_CBD. These results indicate that the phage display technique enables engineering CBDs to have a higher cell wall binding affinity and thus has a great potential to be utilized in the development of effective CBD-based bioprobes. However, this approach was insufficient to reduce the number of clones nonspecifically binding to B. cereus at the panning steps. In order to successfully identify CBD with high cell wall binding affinity through a phage display system, further optimization of the experimental conditions is required. In this study, I engineered endolysins through multiple strategies for control and detection of foodborne pathogens and demonstrated their potentials as biocontrol agents and as bioprobes.
항생제 내성 세균의 발생률이 증가함에 따라, 박테리오파지 (bacteriophage, 파지)에서 유래된 엔도라이신 (endolysin)은 항생제에 대한 유망한 대안 중 하나로서 상당한 주목을 받아오고 있다. 그러나 강력한 능력을 갖는 엔도라이신을 발견하는 것은 시간이 많이 걸리고, 매우 노동 집약적인 작업을 필요로 하며, 용균 활성이 높으면서 가용성 형태의 단백질을 얻는데 어려움이 있다. 이와 관련하여, 엔도라이신이 효소적 활성 도메인 (enzymatic active domain, EAD)과 세포벽 결합 도메인 (cell wall binding domain, CBD)으로 이루어진 모듈형 구조라는 점은 무작위 돌연변이 또는 도메인 교체와 같은 엔도라이신의 engineering을 가능하게 하며, 원하는 특성을 갖는 엔도라이신을 얻는데 효과적으로 이용될 수 있다. 대부분의 황색포도상구균(Staphylococcus aureus) 유래의 파지 엔도라이신은 N 말단의 histidine-dependent amidohydrolases/peptidase (CHAP) 도메인, 중앙의 아미데이즈 (amidase) 도메인 및 C 말단의 CBD로 구성된 구조를 갖는다. 엔도라이신의 도메인 각각에 대한 연구에도 불구하고, 도메인 중 특히 아미데이즈 도메인의 정확한 기능이 밝혀지지 않았다. 엔도라이신의 성공적인 모듈 engineering을 위해서 고려해야 하는 중요한 요소는 각 도메인의 정확한 기능을 이해하는 것이다. 이러한 이유로, 본 연구에서는 황색포도상구균 파지 엔도라이신의 각 도메인에 대한 기능적 분석이 수행되었다. CHAP 도메인이 주로 엔도라이신의 용균 활성을 부여하는 반면, 중앙에 있는 아미데이즈 도메인은 황색포도상구균의 세포벽을 분해하는데 효소 활성을 나타내지 않는 것으로 나타났다. 그러나, 아미데이즈 도메인이 결핍된 엔도라이신은 온전한 엔도라이신에 비해 세포벽 분해 활성이 감소되었다. 녹색 형광 단백질 (EGFP)과 CBD 그리고 EGFP와 아미데이즈 도메인 및 CBD로 구성된 융합 단백질의 세포벽 결합 친화력 비교 실험은 아미데이즈 도메인의 주요 기능이 CBD의 세포벽 결합 친화도를 증가시킨다는 것을 밝혔으며, 이 아미데이즈 도메인의 존재가 엔도라이신의 전체적인 용균 활성을 높여주는데 도움을 준 것을 알 수 있다. 본 연구는 황색포도상구균을 타겟하는 엔도라이신의 아미데이즈 도메인이 CBD의 세포벽 결합에 대한 보조적인 역할을 한다는 것을 제시하였으며, 이는 황생포도상구균을 제어하는데 효과적인 항생제 및 진단 제제를 개발하는 데 유용한 정보가 될 수 있다. 이러한 결과를 바탕으로 원래의 포도상구균 엔도라이신 보다 더 높은 용균 활성을 갖는 엔도라이신을 얻기 위해서 random domain swapping을 수행하였다. Random library에서 LysSA12 CHAP 도메인, LysSA97 아미데이즈 도메인 및 CBD로 구성된 새로운 키메라 엔도라이신인 Lys109이 선정되었고, 황색포도상구균에 대한 용균 활성을 확인했다. 그 결과, Lys109는 황색포도상구균 종에 대해서 원래의 엔도라이신보다 더 강력한 박테리아 용균 활성을 나타냈다. 또한, Lys109는 황색포도상구균의 바이오 필름을 효과적으로 제거하였다. Lys109의 용균 활성은 황색포도상구균으로 오염된 식품 및 스테인리스에서도 확인되었다. 우유에서 황색포도상구균은 900 nM의 Lys109을 처리했을 때, 45 분 이내에 완전히 사멸되어 검출되지 않았다. 반면 LysSA12는 더 높은 농도의 단백질로도 균 사멸 효과를 보이지 않았다. 돼지 고기와 쇠고기의 표면에 황색포도상구균을 오염시키고 50 nM Lys109를 1 시간 동안 처리했을 때, 황색포도상구균이 각각 3-log/cm2와 2-log/cm2 감소되었다. 스테인리스에서 100 nM의 Lys109로 1 시간 처리 한 후에는 완전한 박테리아 사멸이 관찰되었다. 이러한 결과는 새로운 키메라 엔도라이신이 황색포도상구균을 제거하는데 효과적이며, 식품 내 황색포도상구균에 대한 생물 방제제 및 식품 가공이나 조리 과정에서 살균제로 활용 가능성이 높음을 시사한다. 또한 본 연구에서는 황색포도상구균과 바실러스 세레우스 (Bacillus cereus)를 동시에 제어할 수 있는 융합 단백질을 만들었다. 이것은 다른 박테리아 속을 목표로 하는 두 개의 엔도라이신의 융합이 시도된 첫 번째 연구이다. 바실러스 세레우스를 감염하는 파지 B4로부터 유래된 엔도라이신 LysB4의 전체 및 C 말단이 절단된 LysB4EAD를 나선형 링커 (helical linker)를 통해 황색포도상구균 감염 파지 SA11의 엔도라이신 LysSA11에 융합시켰다. 만들어진 전체 길이 엔도라이신의 융합 단백질들은 황색포도상구균과 바실러스 세레우스 모두에 대해 배향 (orientation)에 관계없이 원래 엔도라이신의 강력한 용균 활성을 유지하였다. 또한, 절단 된 융합 단백질도 전체 융합 단백질에 필적하는 용균 활성을 갖고 있었다. 특히, 만들어진 4개의 모든 융합 단백질은 LysSA11에 비해서 높은 열 안정성을 보였으며, LysB4-LysSA11과 LysB4EAD-LysSA11은 LysB4에 비해서도 높은 열 안정성을 나타내었다. 특히, LysB4EAD-LysSA11의 열 안정성 개선 정도가 월등히 높았으므로, 이 단백질을 선정해서 특성 분석 및 응용 연구를 진행하였다. 융합 단백질의 강력한 용균 활성은 밥과 같은 식품에 처리했을 때도 관찰되었으며, 이는 이 단백질이 다중 병원체를 표적 하는 효과적인 항균제로의 활용가능성을 시사한다. 본 연구에서는 엔도라이신 engineering의 새로운 방법으로 파지 디스플레이 시스템을 사용하여 바실러스 세레우스를 감염하는 파지 PBC1의 엔도라이신인 LysPBC1의 CBD의 세포벽 결합 친화도를 향상시키기 위한 실험을 진행하였다. LysPBC1_CBD는 pIII 코트 단백질을 통해 M13 filamentous 파지 표면에 성공적으로 디스플레이되었고, 디스플레이 된 단백질은 바실러스 세레우스에 대해서 결합 능력이 유지되는 것을 확인하였다. 그 후, 파지에 디스플레이 된 LysPBC1_CBD 무작위 라이브러리 (random library)를 구축하였다. 라이브러리의 몇몇 선택된 클론들 중에서, LysPBC1_CBD Q47H 돌연변이체는 LysPBC1_CBD 야생형에 비교하여 세포벽 결합 능력이 약 2 배 증가한 것으로 나타났다. 이 결과는 파지 디스플레이 시스템을 사용하여 CBD의 engineering이 가능하며, CBD 기반의 세균 검출 기술 개발에 활용이 가능함을 시사한다. 그러나 본 연구에서, 패닝 (panning) 단계 동안 바실러스 세레우스균에 비특이적으로 결합하는 클론의 수를 감소 시키는데 한계가 있었다. 파지 디스플레이 시스템을 통해 높은 세포벽 친화성을 갖는 CBD를 성공적으로 선택하기 위해서는 추후에 실험 조건의 최적화가 필요하다. 본 연구는 식중독균을 표적으로 하는 박테리오파지 엔도라이신을 다양한 방법으로 엔지니어링하고 응용함으로써 엔지니어링된 엔도라이신이 생물방제제 및 세균 검출 기술 개발에 활용될 수 있는 가능성을 제시하였다.
Language
eng
URI
https://hdl.handle.net/10371/152145
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