Enhancement of therapeutic efficacy by immunomodulation in human mesenchymal stem cells

Abstract

인간 중간엽 줄기세포는 면역 조절능 및 조직 재생능을 촉진하는 바이오-의료적 특성을 지니고 있어, 최근 다양한 면역 이상 질환에 대한 대체 치료제로서 각광을 받고 있다. 하지만 다년간의 기초 및 전임상 연구에도 불구하고, 위 세포를 이용한 임상 실험의 결과는 편차가 크고, 그 기대에 부응하지 못하는 경우가 많다. 이와 같은 연구 결과와 임상 시험 결과 간의 차이는 이식된 세포의 병변부로의 생착 실패, 낮은 체내 생존율, 공여자에 따라 상이한 세포의 특성 등의 요인으로 인하여 유발된다. 그러므로 현재 중간엽 줄기세포 기반 치료가 직면하고 있는 문제들을 극복하고, 더 향상된 치료 효과를 얻기 위해서 중간엽 줄기세포의 항상성과 치료효능을 증대시킬 수 있는 방안을 개발해야 한다.

인간 제대혈 및 지방조직 유래 중간엽 줄기세포는 다양한 계통의 면역세포를 억제할 수 있는 것으로 알려져 있다. 또한 많은 연구를 통해 위 중간엽 줄기세포의 자가 면역성 질환에 대한 치료 효능 및 관련 치료 기전이 밝혀졌다. 실제로 중간엽 줄기세포로부터 분비되는 Prostaglandin E2 (PGE2)와 같은 면역 조절 인자가 질병을 유발하는 데 핵심 역할을 하는 면역 세포의 작용을 억제할 수 있으며, 이와 관련된 작용 기전이 다각도로 규명되어 왔다. 그러나 이러한 분비인자들의 중간엽 줄기세포에 대한 직접적인 영향과 배양 환경 등의 변화에 따른 면역 조절 인자들의 생산 조절에 대해서는 명확히 밝혀진 바 없다. 그러므로 본 연구의 첫 번째 장에서는 자가 분비된 PGE2가 인간 제대혈 및 지방조직 유래 중간엽 줄기세포의 생장과 줄기세포능에 미치는 직접적인 영향, 더 나아가 세포간 접촉에 의한 PGE2 생산 조절, 이로 인해 발생하는 줄기세포의 면역 조절능 변화 양상을 조사하였다. PGE2의 분비를 선택적으로 억제하기 위해 COX-2 혹은 mPGES-1에 대한 억제제를 처치하고 중간엽 줄기세포의 증식율을 측정하였다. 그 결과, 중간엽 줄기세포에서 EP2 수용체를 통해 PGE2의 분비를 조절하며, 이는 세포의 생장과 직접적인 관련이 있음을 밝혀냈다. 실제로 PGE2의 분비를 억제하였을 경우, G1 cell cycle arrest를 통하여 생포의 증식이 억제되며, 중간엽 줄기세포 유래 PGE2가 이러한 성장 억제를 해소하여 줄 수 있는 것을 밝혔다. 또 동일 수의 세포로부터 생산되는 PGE2의 양은 Gap junction 세포간 신호전달 (Gap junction intercellular communication, GJIC)에 의하여 감소되는 것을 밝혔다. 세포간 접촉에 의한 PGE2 분비량의 감소는 곧 줄기세포의 면역억제능의 저하로 이어진다. 결과적으로 중간엽 줄기세포에 의해 분비된 PGE2는 EP2 수용체를 통해 줄기세포의 자가 증식능의 유지에 기여한다. PGE2의 분비는 세포간 접촉에 의해 저해될 수 있으며, 이는 줄기세포의 면역조절능의 감소를 야기한다.

본 연구의 두 번째 장에서는 NOD2 및 TLR9 수용체의 작용제로 이루어진 MIS416 microparticle의 공동 적용을 통해 염증성 장염에 대한 제대혈 유래 중간엽 줄기세포의 치료 효능을 증진시킬 수 있는지를 조사하였다. 장염 동물실험 모델은 3% Dextran sulfate sodium (DSS) 용액을 음수로 공급하여 유발하며, MIS416과 제대혈 유래 중간엽 줄기세포를 차례로 체내로 주입하였다. 실험동물의 상태를 육안적으로 검사하고, 안락사 후에 추가적인 검사를 위해 혈액, 비장, 결장 조직을 채취한다. MIS416의 작용기전을 분석하기 위해서 제대혈 유래 중간엽 줄기세포 뿐 아니라 혈액으로부터 분리해 낸 면역세포와의 공배양을 진행하고 추가적인 검사를 수행하였다. 그 결과, MIS416을 줄기세포와 공동주입해 준 실험군에서 염증성 장염의 증상이 더욱 효과적으로 완화되며, 복합처치를 통하여 줄기세포의 치료능을 증진할 수 있었다. 그러나 MIS416의 직접 처치는 제대혈 유래 중간엽 줄기세포의 면역 조절능에 대한 변화를 유발하지 않았다. 대신 체내로 주입된 MIS416은 장내 면역 환경의 변화가 줄기세포가 더욱 쉽게 병변부로 이동할 수 있도록 도우며, 염증반응을 효과적으로 억제할 수 있도록 한다. 이에 더하여, MIS416과 중간엽 줄기세포의 상호 작용을 통하여 억제성 T 세포의 장내 침착 및 조절작용이 증대되는 것을 확인하였다. 이 연구 결과를 통해 MIS416의 공동 적용은 체내 염증 반응을 조절하여 제대혈 유래 중간엽 줄기세포의 치료효능이 증진될 수 있음을 증명하였고, 이는 현재 임상 분야에서 줄기세포 기반 연구가 마주한 장애를 극복할 수 있는 효과적인 방안이 될 수 있다.

이 연구 결과들을 통해 (1) 세포간 접촉에 의해 조절되는 PGE2의 분비와 EP2 수용체의 발현은 중간엽 줄기세포의 세포 증식과 면역 억제능에 관여하며, 줄기세포 및 줄기세포 배양액을 이용한 치료제 생산과정에 이러한 세포 생리학적인 특성이 고려되어야 함을 제안하였고, (2) MIS416와의 복합처치를 통해 중간엽 줄기세포의 생착과 면역 억제능을 간접적으로 증진시킬 수 있음을 증명하였다. 결론적으로 본 연구를 통해 중간엽 줄기세포의 면역조절능 저하를 막기 위해 과도한 세포간 접촉을 지양해야 하며, 면역조절물질의 공동 적용을 통해 중간엽 줄기세포의 치료효율이 증강될 수 있음을 밝혔다.

Human mesenchymal stem cells (hMSCs) have recently been considered a promising alternative treatment for diverse immune disorders due to their unique biomedical potentials including the immunomodulatory property and ability to promote tissue regeneration. However, despite many years of research and pre-clinical studies, results from clinical trials using these cells have been diverse and conflicting. This discrepancy is caused by several factors such as poor engraftment, low survival rate and donor-dependent variation of the cells. Enhancement of consistency and efficacy of hMSCs remains a challenge to overcome the current obstacles to hMSC-based therapy and subsequently achieve improved therapeutic outcomes.

Human umbilical cord blood- (hUCB) and adipose tissue-derived (hAD)-MSCs suppress various lineage of immune cells. Many studies have elucidated the clinical efficacy and underlying mechanisms of MSCs in immune disorders. Although immunoregulatory factors, such as prostaglandin E2 (PGE2), and their mechanisms of action on immune cells have been revealed, their effects on MSCs and regulation of their production by the culture environment are less clear. Therefore, in the first part of this study, I investigated the autocrine effect of PGE2 on human adult stem cells from cord blood or adipose tissue, and the regulation of its production by cell-to-cell contact, followed by the determination of its immunomodulatory properties. MSCs were treated with specific inhibitors to suppress PGE2 secretion, and proliferation was assessed. PGE2 exerted an autocrine regulatory function in MSCs by triggering E-Prostanoid (EP) 2 receptor. Inhibiting PGE2 production led to growth arrest, whereas addition of MSC-derived PGE2 restored proliferation. The level of PGE2 production from an equivalent number of MSCs was down-regulated via gap junctional intercellular communication. This cell contact-mediated decrease in PGE2 secretion down-regulated the suppressive effect of MSCs on immune cells. Taken together, PGE2 produced by MSCs contributes to maintenance of self-renewal capacity through EP2 in an autocrine manner, and PGE2 secretion is down-regulated by cell-to-cell contact, attenuating its immunomodulatory potency.

Administration of assistant materials such as small molecules, growth factors and biocompatible particles is known to enhance the therapeutic function of hMSCs against various diseases. MIS416, a novel microparticle which consists of MDP and bacterial DNA for an activation of cytoplasmic receptors NOD2 and TLR9, is phagocytized in vivo and changes immune milieu to resist the pathophysiological environment. In the second part of present study, I investigated whether administration of MIS416 could enhance the therapeutic efficacy of hUCB-MSCs against experimental colitis, using dextran sulfate sodium (DSS)-induced colitis model. Colitis was experimentally induced in mice and mice were examined grossly, and blood, spleen and colon tissues were subsequently collected for further ex vivo analyses. To explore the effects of MIS416 on the therapeutic process, hUCB-MSCs and primary isolated immune cells were cultured with MIS416, and in vitro assays were performed. Compared to the single administration of hUCB-MSCs, co-administration with MIS416 improved the therapeutic efficiency of the stem cells by significantly alleviating the symptoms of inflammatory bowel disease. Interestingly, MIS416 did not exert any direct effect on the immunomodulatory capacity of hUCB-MSCs. Instead, systemically injected MIS416 altered the immune milieu in the colon which caused hUCB-MSCs to be more readily recruited towards the lesion site and to suppress inflammation more efficiently. In addition, considerable numbers of regulatory immune cells were stimulated as a result of the cooperation of MIS416 and hUCB-MSCs. These findings indicate that co-administration with MIS416 enhances the therapeutic potential of hUCB-MSCs by systemically regulating the immune response, which might be an effective strategy for overcoming the current obstacles to stem cell therapy in clinical practice.

In conclusion, these findings imply that (i) cell proliferation and immunosuppression of hMSCs are augmented by autocrine PGE2 and its subtype receptor EP2, of which secretion and expression are impeded by cell-to-cell contact and this physiological feature may be applied to preconditioning process of the cells or cell-cultured medium, and (ii) co-administration of microparticle MIS416 changes systemic immune milieu to improve migration into lesion sites and immune suppressive capacity of hUCB-MSCs. Consequently, this study suggests preconditioning related to cell contact status and co-administration of MIS416 as enhancement strategies for therapeutic efficacy of hMSCs.