차세대염기서열분석을 이용한 신장이식환자의 타크로리무스 농도와 연관된 새로운 유전형 발굴

Abstract

1. 서론

타크로리무스는 면역억제제로서 대부분의 고형장기 이식 환자에서 널리 쓰이고 있으나 치료 영역이 좁고 개인간 약동학적 변동이 커 개인맞춤 요법을 필요로 하고 있다. 체중 기준으로 투약을 시작하고 최저 약물농도측정(therapeutic dose monitoring, TDM)을 통해 용량을 조절함으로써 부작용을 최소화하고 이식편 거부반응을 줄이고 있다.

투여 초기부터 약물농도를 조절하기 위해 타크로리무스 약동학에 영향을 미치는 인자에 대한 연구가 다양하게 시행되었고, 병용약물, 유전형, 식이요법 및 화학적 랩 검사가 보고되었다. 유전형으로 CYP3A5 rs776746 단일염기다형성은(single nucleotide polymorphism, SNP), 인트론 3 (6986 A>G, CYP3A5*3) 위치의 대립형질(allele), 이상 전령 리보핵산(messenger ribonucleic acid, mRNA) 스플라이싱을 통해 CYP3A5 효소의 발현을 조절함으로써 주요하게 약물 대사에 영향을 미친다. 본 유전형은 영향력이 크지만, 현재 40-50%만의 변이를 설명하므로 다른 유전형의 역할에 대한 연구들이 진행되었다. CYP3A4, POR, NR1I2, 그리고 SUMO4가 보고되었으나 여전히 타크로리무스의 약동학적 다양성에 대한 설명이 충족되고 있지 않다.

유전체 분석 기술이 발전함에 따라 광범위 유전체 연구와 차세대 염기서열분석(next generation sequencing, NGS)를 통해 잠재적인 새로운 SNP을 발굴하게 되었다. 따라서 본 기술을 통해 타크로리무스와 연관된 새로운 약동학 관련 유전자를 발견할 것으로 기대된다. 본 연구에서는 신장이식 환자에서 타크로리무스에 영향을 미치는 새로운 유전형을 알아내고자 하였다.

2. 연구방법

본 연구는 단일 기관 후향적 관찰 연구로 수행되었다. 2007년부터 2014년까지 서울대병원에서 신장이식을 새로 받은 18세 이상 성인 중 타크로리무스(Prograf®) 포함한 면역억제 삼중요법을 받는 환자가 포함되었다. 다장기 이식 또는 이식적 탈감작 요법을 받은 환자는 제외되었다. IRB 승인을 받아 총 147명 환자가 모집되어 75명은 발굴군, 72명은 재현군으로 분류되었다.

타크로리무스는 0.075 mg/kg 1일 2회로 이식전 시작하여 TDM에 따라, 이식후 1개월째 10-12 ng/mL, 3개월째 8-10 ng/mL, 6개월째 6-8 ng/mL, 이후 4-6 ng/mL로 용량이 조절되었다. 타크로리무스 농도는 액체크로마토그래피 질량분석법으로 측정되었다. 혈중 최정 농도는 1-3일, 4-7일, 8-14일, 15-28일, 1-3개월, 4-6개월, 7-12개월의 평균값으로 계산되었고 총 콜레스테롤, 적혈구, 총 빌리루빈, 알부민, 크레아티닌과 같은 임상변수 정보가 수집되었다.

대상환자의 혈액은 전향적으로 수집되어 QuickGene DNA kit로 유전적 데옥시리보핵산(genomic deoxyribonucleic acid, gDNA)를 추출하였다. Sure Select Human All Exon kit V5 + UTRs (Agilent) 키트를 통해 gDNA 표적부위를 캡쳐하여 증폭시켰다. Bioanalyzer를 통해 상태 검사후 Ion PI chip에 로딩하여 Ion Proton로 시퀀싱하였다. Torrent Mapping Alignment Program ver4.0.6으로 매핑하여 Torrent Variant Caller plugin ver4.4.3.3으로 서열을 호출하였다. 소수형질빈도(minor allele frequency, MAF)는 SNVrap을 통해 주석을 달았다. 차세대염기서열분석의 염기서열은 Sanger sequencing으로 검증하였다. 타크로리무스 영향 유전형 중 표적부위에 포함되지 않은 ABCB1, ABCC2, ABCG2, CYP3A4, CYP3A5, NR1I2, POR, PPARA, PPARD, SLCO1B3 그리고 SUMO4 유전자의 19개 변이는 SNaPshot 또는 SNPtype assay로 별도로 분석하였다.

용량 보정 농도(C/D)는 타크로리무스 혈중 최저농도를 1일 투여용량으로 나눈 값으로 계산되었다. 상관분석을 위해 log 변환시켰고, ANOVA 선형 회귀분석을 부가모델(addivite model)로 매 시점 분석되었다. 거짓발견비율(false positive rate, FDR)로 보정하여 p<0.05를 유의한 것으로 판단하였다. 확인된 유전변이는 Hardy-Weinberg 평형 관계를 평가하였다. 선형혼합모형(linear mixed model, LMM) 분석을 통해 매 시점 유전형과 임상변수에 대한 관계를 보았다. Haploview 프로그램을 통해 일배체병(haplotype)과 연관 불평형(linkage disequilibrium, LD)이 측정되었다.

3. 연구결과

모집된 환자는 발굴군과 재현군에서 인구학적 특성의 유의한 차이를 보이지 않았다. 차세대 염기서열 분석은 평균 측정(depth)이 57.78x (41.09-105.5)이었고, 표적부위에서 20x 이상 측정된 비율은 87.87% (77.87-96.09)이었다. 총 293,531개 변이가 확인되었다. 발굴군의 2,900개의 C/D 값과 변이 간 상관분석 결과 chromosome 3의 NR1I2, chromosome 7의 PTCD1, CPSF4, ZNF789, ZKSCAN5, FAM200A, ZSCAN25, CYP3A5, CYP3A7, 그리고 CYP3A4가 확인되었다. FDR 보정 결과 총 16개 변이가 전기간 의미가 있었고 CYP3A7 rs2257401의 C>G 변이가 3일째 가장 영향이 컸다(전기간 p = 1.74 x10-7 and p = 0.0138).

Chromosome 7의 haplotype 분석 결과 CPSF1 rs883403와 rs1043466, ZNF789 rs6962772, FAM200A rs10238965, 그리고 ZSCAN25 rs1859690가 한 블록, ZSCAN25 rs3735453, CYP3A5 rs15524와 rs776746, CYP3A7 rs10211, rs12360와 rs2257401, 그리고 CYP3A4 rs12333983가 각각 블록을 형성하였다.

재현군에서는 2,940개의 타크로리무스 농도가 수집되었고, 1인당 34(27-77)회 측정되었다. 발굴군에서 유의하게 측정된 변이 CYP3A5 rs15524와 rs776746, CYP3A7 rs10211, rs12360와 rs2257401, 그리고 CYP3A4 rs12333983와 rs2242480가 분석되었다. 모든 변이가 유의하게 C/D에 영향을 미침이 확인되었다. ZNF789 rs6962772, FAM200A rs10238965, 그리고 CYP3A7 rs10211와 rs12360의 SNP이 동일함이 보여 향후 분석에서 제외되었다. LD 정도는 각각 CYP3A7 rs2257401와 CYP3A5 rs776746 (r2 = 0.79)가 높고, CYP3A4 rs2242480와 CYP3A5 rs776746 (r2 = 0.50)가 중등도이었다. 이에 이배체형(diplotype) 빈도를 확인하여 CYP3A5 rs15524와 rs776746, CYP3A7 rs10211와 rs2257401, 그리고 CYP3A4 rs12333983로 CAGCA-CAGCA, TGAGT-TGAGT 및 그 외 서열은 각 9.3%, 45.3%, 44.2%이었고 TGAGT-TGAGT는 타크로리무스 C/D를 강하게 증가시켰다.

모든 환자군을 합쳐 LMM 분석을 한결과 최종적으로 CYP3A7 rs2257401 유전형과 나이, 알부민, 적혈구용적율, 크레아티닌이 최종 포함되었다. CYP3A7 rs2257401 변이의 영향을 확인하고자 CYP3A5 발현자와 비발현자로 구분하여 각 유전형과 C/D의 영향을 확인한 결과 CYP3A5 발현군에서도 CYP3A7 rs2257401 변이가 타크로리무스의 C/D에 유의하게 영향을 미침을 확인하였다.

4. 결론

본 연구는 CYP3A7 유전형이 타크로리무스 C/D의 개인차에 강하게 연관됨을 입증하였다. 따라서, CYP3A7 rs2257401 다형성이 신이식 환자에서 최적화된 개인 맞춤 타크로리무스 용량과 용법을 제시하는데 활용될 것으로 기대된다.

Although tacrolimus have been studied widely for variation of its pharmacokinetics (PK), there is currently no consensus on the best individualized dosing method of tacrolimus. The purpose of this study was to identify genotypes associated with tacrolimus dose-adjusted trough concentration (C/D) in Korean kidney transplant recipients using whole-exome sequencing (WES).

A total of 147 patients administering tacrolimus in seventy-five of the discovery set and seventy-two of replication set. Data was collected retrospectively from 80 kidney transplant recipients treated with tacrolimus for the first year. Tacrolimus trough concentrations measured by LC-MS/MS were collected. Average tacrolimus C/D were calculated and log transformed for PK parameters (logC/D) in each period. The genomes of the patients in the discovery set were sequenced using WES. Known tacrolimus pharmacokinetics related intron variants were genotyped. Genetic variants associated with logC/D were analyzed by ANOVA and adjusted by false discovery rate. Haplotype was tested with the variants in same chromosome by Haploview software. Linear mixed effect model was constructed with clinical variables and identified variants in R ver3.4.4.

Ten genes, NR1I2 on chromosome 3 and CYP3A7, CYP3A5, CYP3A4, PTCD1, CPSF4, ZNF789, ZKSCAN5, FAM200A, ZSCAN25 and on chromosome 7, were identified. Among the 16 identified variants, CYP3A7 rs2257401 was found to be the most significant variant among the periods (between p = 1.74 x10-7 and p = 0.0138). Haplotype was tested with the 13 variants in chromosome 7 showing two linkage disequilibrium blocks. One block included CYP3A5 variants with CYP3A4 and CYP3A7 variants. CYP family diplotype also showed significant difference in each group. Further, CYP3A7 rs2257401 genotype variant showed a significant difference in tacrolimus C/D for those expressing CYP3A5 showing its own effect. The linear mixed effect model was used to account for effect of variants and clinical factors. In linear mixed effect model, age, serum albumin, creatinine, hematocrit and CYP3A7 rs2257401 was included.

The results suggest that CYP3A7 rs2257401 may serve as a significant genetic marker for tacrolimus pharmacokinetics in kidney transplantation.