Studies on the Mechanism of Tie2 Signaling by Ca2+/Calmodulin in Angiogenesis and of Integrin αIIbβ3 Activation by Natural Products

Abstract

혈관내피세포에서 주로 발현되는 Tie2는 막단백질 키나아제로, 발달 단계에서의 혈관 형성 또는 암의 성장에 필수 과정인 혈관 신생에 중요한 역할을 하는 것이 잘 알려져 있다. 본 연구에서는 Tie2의 활성이 칼슘/칼모듈린에 의해 음성적으로 조절되는 기작을 생화학적, 세포생물학적 기법 및 in vivo 실험으로 다음의 내용을 통해 검증하였다. 첫째, 혈관내피세포(HUVEC)에 calcium ionophore 처리에 의한 세포내 칼슘농도를 증가시켰을 때, Tie2 리간드인 Ang1에 의해 증가된 Tie2 활성이 감소하는 현상을 확인하였다. 둘째, Tie2 세포외도메인이 제거된 돌연변이 모델 시스템을 이용한 기작 연구결과, Tie2 활성 저해 현상은 칼슘이온 특이적임을 확인하였다. 셋째, 칼슘 수용체인 칼모듈린과 Tie2가 상호작용을 하는 것을 확인하였으며, Tie2의 1113번째 티로신 잔기가 칼모듈린-Tie2 상호작용에 필수적임을 확인하였다. 넷째, calcium ionophore 처리에 의한 Tie2의 활성 저해 현상은 칼모듈린과-Tie2간의 상호작용이 존재할 때만 관찰되는 것을 확인하였으며 다섯째, 칼모듈린이 결합하지 못하는 Tie2 돌연변이를 아프리카 발톱 개구리 혈관 형성 모델에 적용한 결과 혈관이 비정상적으로 형성되는 것을 관찰하였다. Tie2의 양성조절 기작을 통해 혈관 신생과정을 저해하기 위한 기존의 연구와 달리, 본 연구를 통해 혈관이 정상적인 구조를 형성함에 Tie2의 음성조절 기작이 기여함을 밝혔다.

세포부착 막 단백질인 인테그린은 α와 β 서브유닛이 조직에 따라 다양한 조합을 이루며 발현한다. 그 중 인테그린 αIIbβ3는 혈소판 특이적으로 발현되며, 세포내 작용제인 탈린 단백질이 β3 세포내 도메인에 결합하여 β3의 인지질 이중층에서의 위상차 변화를 야기하고, α와 β의 막 통관부위의 상호결합을 저해함으로써 구조적 변화를 유도한다. 이로 인해 리간드인 피브리노겐과의 결합부위가 노출되어 혈소판 응집을 형성하기 때문에 지혈 작용에 중요함이 잘 알려져 있다. 인테그린의 리간드 결합부위에 경쟁적으로 결합하는 기존의 항혈소판제의 경우 인테그린의 정상적인 기능을 위한 활성조차 저해하기 때문에 출혈의 부작용이 있다. 따라서 본 연구는 리간드 결합부위가 아닌 세포내 인테그린 작용제 탈린을 타깃하는 새로운 작용기작의 항혈소판제 개발을 위한 연구 내용으로 심혈관 질환 개선에 도움을 주는 것으로 잘 알려진 녹차의 주성분인 EGCG를 이용한 연구와, 믹소박테리아에서 발견되는 천연물 유도체인 Indothiazinone을 이용한 연구 결과이다.

EGCG를 인테그린 αIIbβ3를 지속적으로 활성화 시키도록 탈린을 발현시킨 세포주에 처리하였을 때, 인테그린 αIIbβ3 활성이 저해되는 현상을 관찰하였다. 하지만, 탈린을 발현시키지 않은 세포주에 EGCG를 처리하였을 때에도 인테그린 αIIbβ3 활성이 증가되는 현상을 관찰하였다. 본 현상의 기작을 규명하기 위해 정제된 인공세포막인 나노디스크 시스템을 이용하였다. 인테그린 αIIbβ3의 활성은 β3 막 통관부위가 인지질 이중층에서의 위상차 변화에 의해 조절되므로, 나노디스크로 불리는 인공세포막에 인테그린 β3 막통관부위를 삽입하여 위상 변화를 확인하였다. 이를 위해 인테그린 β3 막통관부위 양 끝에 소수성/친수성 환경에 따라 발광 증감의 성질을 지닌 mero60 형광물질을 결합하여 발광 정도를 측정하였다. 인테그린 β3가 삽입된 나노디스크에 탈린을 넣어주었을 때, 형광물질의 발광이 증가함을 확인하였으며 이는 나노디스크에 삽입된 인테그린 β3 막 통관부위의 기울기가 증가하여 형광물질이 소수성인 인지질 이중층 안쪽으로 향한 것을 의미한다. 이 조건에서 EGCG를 처리하였을 때 이러한 증가된 인테그린 β3 막 통관부위의 기울기가 감소되는 현상을 관찰했으며, 탈린이 없는 조건에서도 인테그린 β3 막 통관부위 기울기를 감소시키는 현상을 확인하였다. 이와 같은 EGCG의 pleiotropic 한 효과는 EGFR 발현 세포주에서도 확인 하였으며, EGFR의 막통관부위를 정제하여 나노디스크에 삽입 후 위상 변화를 관찰한 결과 인테그린과 마찬가지로 EGFR 막통관부위 위상변화를 감소시키는 것을 확인하였다.

Peiotropic 효과가 없는 항혈소판제 개발을 위하여 EGCG 화학구조 기반의 천연물 유도체 라이브러리를 이용한 스크리닝을 수행하였다. 인테그린 αIIbβ3 발현 세포주에 천연물 유도체 라이브러리 전처리를 한 후 피브리노겐이 코팅된 96-well plate에 세포 부착을 저해하는 유효물질을 선별하였다. 그 중 믹소박테리아에서 발견되는 천연물 유도체인 Indothiazinone을 발견하였다. Indothiazinone은 ADP 또는 thrombin 처리에 의한 인간 혈소판의 피브리노겐 매트릭스 위에서 퍼짐을 저해하였으며, 탈린을 발현시킨 인테그린 αIIbβ3 발현 세포주의 활성을 저해함을 확인하였다. EGCG와 달리 Indothiazinone 단독 처리에 의한 인테그린 αIIbβ3의 활성이 증가하지 않음을 확인하였고, 탈린에 의해 증가된 인테그린 αIIbβ3 활성이 세포 표면에서 인테그린의 발현을 감소시키지 않음을 확인했다. 분자 동역학 모델링 기법을 이용하여 인테그린 β와 탈린이 결합하는 부위에 Indothiazinone이 결합할 수 있는 가능성을 확인하였으며, 이를 바탕으로 탈린 야생형 및 돌연변이 단백질을 정제하여 SPR 실험을 수행했다. 그 결과 Indothiazinone이 탈린 야생형에 농도 의존적으로 직접 결합하는 것을 확인하였으며, 돌연변이 탈린에는 결합정도가 감소한 것을 관찰했다. 이는 Indothiazinone이 인테그린 β와 탈린간의 상호작용을 저해함으로 인해 인테그린 αIIbβ3의 활성을 저해할 가능성이 있음을 시사한다. 결과적으로 본 연구는 EGCG의 pleiotropic 한 효과가 막 단백질 인테그린과 EGFR의 막 통관부위 기울기를 조절함으로 인해 막단백질의 활성이 조절 될 수 있음을 규명했으며, 탈린을 타깃으로 하는 새로운 작용기전의 항혈소판제로써 Indothiazinone이 선도 물질로 개발될 가능성을 검증한 연구 결과이다.

Angiogenesis, the process of building complex vascular structures, begins with sprout formation on preexisting blood vessels, followed by extension of the vessels through proliferation and migration of endothelial cells. Based on the potential therapeutic benefits of preventing angiogenesis in pathological conditions, many studies have focused on the mechanism of its initiation as well as control. However, how the extension of vessels is terminated remains obsecure. Thus, I investigated the negative regulation mechanism.

I report that increased intracellular calcium can induce dephosphorylation of the endothelial receptor tyrosine kinase Tie2. The calcium-mediated dephosphorylation was found to be dependent on Tie2-calmodulin interaction. The Tyr1113 residue in the C-terminal end loop of the Tie2 kinase domain was mapped and found to be required for this interaction. Moreover, mutation of this residue into Phe impaired both the Tie2-calmodulin interaction and calcium-mediated Tie2 dephosphorylation. Furthermore, expressing a mutant Tie2 incapable of binding to calmodulin or inhibiting calmodulin function in vivo causes unchecked growth of the vasculature in Xenopus. Specifically, knockdown of Tie2 in Xenopus embryo retarded the sprouting and extension of intersomitic veins. Although human Tie2 expression in the Tie2-deficienct animals almost completely rescued the retardation, the Tie2(Y1113F) mutant caused overgrowth of intersomitic veins with strikingly complex and excessive branching patterns.

I propose that the calcium/calmodulin-dependent negative regulation of Tie2 can be used as an inhibitory signal for vessel growth and branching to build proper vessel architechture during embryonic development.

Epigallocatechin gallate (EGCG) is the principal bioactive ingredient in green tea and has been report ed to have many health benefits. EGCG influences multiple signal transduction pathways related to human diseases, including redox, inflamation, cell cycle, and cell adhesion pathways. However, the molecular mechanisms of these varying effects are unclear, limiting further development and utilization of EGCG as a pharmaceutical compound. Here, I examined the effect of EGCG on two representative transmembrane signaling receptors, integrin αIIbβ3 and epidermal growth factor receptor (EGFR). I report that EGCG inhibits talin-induced integrin αIIbβ3 activation, but it activates αIIbβ3 in the absence of talin both in a purified system and in cells. This apparent paradox was explained by the fact that the activation state of αIIbβ3 is tightly regulated by the topology of β3 transmembrane domain (TMD)

increases or decreases in TMD embedding can activate integrins. Talin increases the embedding of integrin β3 TMD, resulting in integrin activation, whereas I observed here that EGCG decreases the embedding, thus opposing talin-induced integrin activation. In the absence of talin, EGCG decreases the TMD embedding, which can also dirupt the integrin α-β TMD interaction, leading to integrin activation. EGCG exhibited similar paradoxical behavior in EGFR signaling. EGCG alters the topology of EGFR TMD and activates the receptor in the absence of EGF, but inhibits EGF-induced EGFR activation. Thus, this widely ingested polyphenol exhibits pleiotropic effects on transmembrane signaling by modifying the topology of TMDs.

Cardiovascular disease, which is caused by unregulated platelet aggregation, is one of the main causes of deaths worldwide. Many studies have focused on natural products with antiplatelet effects as a safe alternative therapy to prevent the disease. In this context, an in-house chemical library was screened to find natural products capable of inhibiting the interaction between platelet integrin αIIbβ3 and fibrinogen, which is an essential step in platelet aggregation. On the basis of the screening results, indothiazinone, an alkaloid found in microbial culture, was identified as a potential antiplatelet agent. Specifically, indothiazinone treatment significantly inhibited the binding of fibrinogen to Chinese hamster ovary cells expressing integrin αIIbβ3. It also restricted thrombin-and adenosine diphosphate-dependent spreading of human platelets on a fibrinogen matrix. More importantly, surface plasmon resonance and molecular dynamics studies suggested that indothiazinone suppressed talin-induced activation of integrin αIIbβ3 presumably by inhibiting talin-integrin interaction. In conclusion, theses results suggest that indothiazinone can be used as a lead compound for the development of antiplatelet drugs with a nove mode of action.