Directed evolution of CRISPR-Cas9 to increase its specificity

Abstract

The use of CRISPR-Cas9 as a therapeutic reagent is hampered by its off-target effects. The determination of the Cas9 crystal structure (Nishimasu, H., et al., 2014) enabled scientists to rationally design mutant Cas9 proteins (enhanced Specificity Cas9 (eSpCas9) and Cas9-High Fidelity (Cas9-HF)) with higher specificities than wild-type Cas9 (WT-Cas9). Their design was based on the hypothesis that weakening non-specific interactions between a Cas9-RNA complex and its substrate DNA would reduce both on-target and off-target activities alike. Since on-target activity is generally much higher than off-target activity, these mutant Cas9 variants would show higher specificities than WT while retaining on-target activities. However, it has been reported that both eSpCas9 and Cas9-HF were poorly active at some target sites (Kim, S. et al., 2017

Kulcsar, P.I., et al., 2017

Zhang, D., et al., 2017) calling for alternative approaches to improve Cas9 specificity. More recently, three additional Cas9 variants, termed evoCas9, HypaCas9 and xCas9-3.7 with improved specificity and activity were developed, reflecting unmet needs in this field.

Although rationally designed S. pyogenes Cas9 (SpCas9) variants that display higher specificities than the wild-type SpCas9 protein are available, these attenuated Cas9 variants are often poorly efficient in human cells. Here, we develop a directed evolution approach in E. coli to obtain Sniper-Cas9, which shows high specificities without sacrificing on-target activities in human cells. Unlike other engineered Cas9 variants, Sniper-Cas9 shows WT-level on-target activities with extended or truncated sgRNAs with further reduced off-target activities and works well in a preassembled ribonucleoprotein (RNP) format to allow DNA-free genome editing.

인간과 여러 동식물들의 게놈 지도가 완성되면서 유전체 조절에 대한 관심이 올라가게 되었다. 유전학에서는 세포 수준에서 발현되는 유전자의 조절이 필수 불가결한 요소이다. 다양한 유전자의 기능이 밝혀지고, 질병과 관련된 유전자의 조절을 하는 데 많은 연구가 진행됨에 따라 유전자를 표적으로 할 수 있는 Zinc finger nuclease, TALE nuclease, CRISPR-Cas9과 같은 유전자 결합 단백질에 대한 연구도 활발히 진행되고 있다.

CRISPR-Cas9은 다루기 쉽고, 효율도 좋은 강력한 단백질 시스템으로 자리잡고 있으나, 목표한 유전자가 아닌 비특이적인 결합으로 다른 유전자와 결합을 할 수 있다는 단점이 있다. 이를 해결하기 위해서 특이성이 올라간 Cas9을 개발하는 연구들이 진행되고 있다. 주된 연구 방식으로는 구조적 정보를 기반으로 RNA와 보다 정확하게 결합할 수 있도록 단백질의 정보를 바꿔주는 합리적인 디자인 방법과 임의의 돌연변이를 정보를 넣어주고 이를 대장균과 같은 생물체를 이용하여 유도진화를 통해서 목표로 하는 단백질을 얻어내는 방식이 있다.

이번 연구에서는, 대장균을 숙주로 유도 진화 방법을 이용하여 정확성이 향상된 Cas9 단백질을 만드는 일을 진행하였다. 한 번에 양성선택과 음성선택을 동시에 진행할 수 있는 Sniper 스크리닝을 고안하고 이를 이용해서 목표로 하는 단백질인 Sniper-Cas9을 선별해 낼 수 있었다. 선별한 후 기존에 개발된 여러가지 Cas9 단백질들과 비교를 통해서 찾아낸 Sniper-Cas9이 정확성이 향상되었고 다른 단백질들은 사용할 수 없는 여러가지 sgRNA와도 문제 없이 결합을 할 수 있다는 것을 확인하였다.