Isolation and genomic characterization of Escherichia coli enriched within the tissues of oral lichen planus lesions

Abstract

1. Background

Oral lichen planus (OLP) is a T cell-mediated chronic mucocutaneous disease by unknown etiology. Many researchers have suggested that the potential antigens including autoantibodies, dental materials, and infectious agents are recognized by CD8+ T cells. However, the precise pathogenesis of OLP is not understood.

Many research groups have been focused on the relationship between the bacterial infection and the onset of OLP. Recently, advent of sequencing technologies for analysis of large amount bacterial communities allow researcher to study bacterial profiles using small amount DNA samples. It has been reported that the microbiota of saliva and buccal mucosa showed the differences between healthy controls and OLP patients. However, the bacterial communities within the tissues of OLP lesions have not been studied. The present study aimed to characterize the oral microbiota within the tissues of OLP lesions compared with the mucosal surface and to characterize the genome of the bacterial species enriched within OLP lesions.

2. Methods

To compare the oral microbiota, the buccal mucosal bacteria (OM) or biopsies (OT) of OLP lesions were obtained from 10 patients with OLP. The mucosal bacteria (HM) from 5 healthy subjects were additionally used. The bacterial genomic DNA was extracted from the mucosal samples and tissues. In case of the tissue samples, the tissues were treated with lysozyme, antibiotics, and DNase I before extraction of genomic DNA to remove the surface bacteria on the tissues. To analyze the microbiota of mucosal surface and tissues of OLP lesions, DNA fragments including V1-V3 or V3-V4 hypervariable regions of the bacterial 16S rRNA gene were amplified by PCR, and then the PCR product were sequenced using a 454 GS FLX Titanium or an Illumina MiSeq sequencing system. For the analysis, the sequencing data of mucosal samples from 11 healthy individuals and 13 OLP patients in a previous study were additionally used.

Four clinical isolates of Escherichia coli (K12-5.1, 7.1, 7.2, and 7.3) were obtained from 2 OLP patients and then subjected to whole genome sequencing.

For the preliminary animal experiment to develop the animal model for OLP, ICR mice were orally inoculated with viable E. coli K12-7.2. Then the bacterial invasion and infiltration of immune cells within the tongue tissues were confirmed by in situ hybridization and H&E stain.

3. Results

The bacterial loads of OM (n = 7) communities were significantly increased compared with HM (n = 5) and OT (n = 9) communities. The bacterial richness were different between OM (n = 20) and OT (n = 9). In terms of bacterial composition, 3 phyla, 13 genera, and 90 species/phylotypes showed significant differences in the relative abundance among groups.

In the analysis of microbiota between mucosa and tissues from same sites of 7 OLP patients, the bacterial richness and diversity were not different between 2 groups. However, the relative abundances of 2 phyla, 8 genera, and 52 species/phylotypes were totally different between OM and OT. Among 52 species differently distributed between OM and OT, E. coli was highly enriched in the tissue communities.

Whole-genome sequencing analysis revealed that 4 clinical isolates of E. coli phylogenetically belonged to E. coli K-12 strains. However, the gene contents of the 4 isolates were partially different from those of K-12 reference strain MG1655 isolated from human feces.

In the animal experiment, the bacterial invasion and immune infiltration within the tongue tissues were compared between sham and E.coli inoculated groups. However, there were no significant differences in the bacterial invasion between groups. In addition, the immune cell infiltration was not observed in E. coli inoculated group.

4. Conclusion

In conclusion, this is the first study to identify the bacterial communities within the tissues of OLP lesions compared with those of the mucosal surface. Understanding the role of E. coli enrichment within the tissues in the pathogenesis of OLP may provide a new insight into the etiopathogenesis of OLP.

1. 목 적

구강편평태선은 T 림프구가 매개하는 만성 염증성 점막 상피 질환으로, 정확한 원인과 병인기전은 밝혀지지 않았다. 상피에 존재하는 미지의 항원에 의해 CD8+ T 세포가 활성화되어 상피세포와 기저막을 공격하여 파괴되는 것으로 이해되고 있다. 자가 항원, 치과 수복물, 감염 등이 세포 독성 T 세포 반응을 유발하는 미지의 항원으로 거론되고 있지만, 정확한 원인은 분명하지 않다.

세균 감염과 구강편평태선 발병 사이의 관계에 많은 연구자들이 주목하였고, 최근 염기 서열 분석 기술을 통해 구강편평태선 환자와 건강인의 타액 또는 점막 세균의 차이를 보여주는 연구 결과들이 보고되고 있다. 건강인과 비교하였을 때 구강편평태선 병소 조직 내에서 유의한 세균 증가가 관찰됨에도 불구하고, 구강편평태선 병소 조직 내에 존재하는 세균에 대해서는 보고된 바가 없다. 따라서 본 연구의 목적은 구강편평태선 병소 조직과 점막 표면에 존재하는 세균 공동체를 비교 분석하고, 구강편평태선 병인기전과 관련 있을 것이라 여겨지는 세균을 분리ᆞ동정 하는 것이며, 구강편평태선 동물 모델을 확립하는 것이다.

2. 방 법

구강편평태선 환자의 병소 점막 표면과 조직 내에 존재하는 세균의 조성을 비교하기위해, 11명의 구강편평태선 환자로부터 병소 점막에 존재하는 세균 또는 병소 부위 생검을 얻었으며, 두 샘플을 모두 얻은 환자는 총 7명이다. 이 중, 2명 환자의 조직은 세균 분석에 이용하지 않고 조직 내 세균을 분리하는데 이용하였다. 각 샘플로부터 세균의 DNA를 추출하여 세균 분석을 진행하였고, 조직 샘플의 경우 표면에 존재하는 세균을 제거하기위해서 DNA를 추출하기 전에 라이소자임, 항생제, DNA 분해효소를 처리하였다. 추출한 DNA는 세균의 16S rRNA 유전자 V1-V3 또는 V3-V4 가변부위를 중합효소 연쇄 반응으로 증폭시켜, 454 GS FLX Titanium 또는 Illumina MiSeq 시스템을 통해 염기 서열 분석 하였다. 세균 조성 분석을 위해, 이전 연구에서 사용한 11명의 건강인, 13명의 구강편평태선 환자의 점막 세균 데이터를 포함하여 분석하였다. 샘플 내 세균 양은 실시간 중합효소 연쇄 반응을 통하여 정량하였다.

병소 조직으로부터 대장균을 분리하기 위하여, 환자 2명의 조직을 이용하였다. 조직 표면의 세균을 제거한 후에, 조직을 잘게 잘라 액체 배지에서 하루 배양 하고, 배양액을 고체 선택배지에서 배양하였다. 고체 배지 위에 자란 미생물 집락을 대장균-특이적 프라이머를 이용하여 중합효소 연쇄 반응으로 확인한 후, 염기 서열 분석을 통해 세균을 동정하였다. 환자 조직에서 분리ᆞ동정한 4개의 대장균 (K12-5.1, 7.1, 7.2, 7.3) 으로부터 DNA를 추출하여 전체 게놈 염기 서열 분석에 이용하였다.

구강편평태선 동물 모델을 확립하기 위해, 살아있는 대장균 K12-7.2를 (109/마리 당) ICR 암컷 생쥐 구강 내로 일주일에 한 번씩 주입하였다. 기간 별로 세균의 조직 내 침투와 면역세포의 침윤을 관찰하기 위해, 세균 접종 16시간, 7, 14, 21, 28일 후에 생쥐를 희생하여 혀 조직을 얻고, 대장균-특이적 탐침자를 이용한 가시적 분자 결합화와 H&E 염색을 수행하였다.

3. 결 과

실시간 중합효소 연쇄 반응을 통해 전체 세균 양을 확인하였더니, 구강편평태선 환자의 점막 샘플에서의 세균 양이 건강인의 점막 샘플, 구강편평태선 환자의 조직 샘플에 비해 통계적으로 유의하게 높았다. 세균 조성을 문 (phylum), 속 (genus), 종 (species) 수준에서 비교하였더니, 3개의 문, 13개 속, 90개 종이 통계적으로 유의하게 세 그룹 간에서 차이를 보였다.

각 환자 내에서 점막 표면과 조직 내 존재하는 세균의 변화를 관찰하기 위해서 샘플을 모두 얻은 7명의 세균 데이터만을 다시 비교하였다. 실시간 중합효소 연쇄 반응을 통해 정량한 세균 양은 점막 표면 샘플 군보다 조직에서 유의하게 감소하였고, 세균 종 풍부도와 다양성 지표는 두 그룹간에 차이가 없었다. 그러나 세균 조성 비교에서는, 2개의 문, 8개 속, 52개 종이 통계적으로 유의하게 두 그룹간에 차이를 보였다. 두 그룹 간에서 차이를 보인 52개 종 중에서, 특히 대장균은 조직의 세균 공동체에서 유의한 증가를 보였다.

구강편평태선 환자 병소 조직으로부터 분리한 4개 대장균 임상 균주는 전제 유전체 분석을 통해 대장균 K-12 균주와 유사한 것을 확인하였다. 그러나 임상 균주는 대장균 K-12 MG1655와는 약간 다른 유전자 프로파일을 보였다.

동물 실험에서, 대장균 임상 균주를 구강 내로 주입한 그룹과 대조군 간에 세균의 조직 내 침투와 면역세포 침윤 정도를 비교하였다. 세균의 조직 내 침투는 큰 차이를 발견하지 못하였으며, 실험군에서 면역 세포의 침윤을 관찰하지 못하였다.

4. 결 론

본 연구에서는 최초로 구강편평태선 환자 병소 부위의 점막 표면과 조직 내 사이의 세균 조성 차이를 관찰하였다. 특히 점막 표면과 비교했을 때, 병소 조직 내에서 상대적 존재 비가 크게 증가한 대장균의 역할을 이해한다면, 구강편평태선의 병인기전을 이해하는 데 새로운 시각을 제공 할 수 있을 것이다.