아이소자임 구별 연구

Abstract

다른 종류의 효소는 상이한 기질 때문에 구분이 쉬운 반면 활성자리의 구조가 거의 동일한 아이소자임은 그 구분이 어렵다. 하지만 표적 효소에 대해 부작용 없는 신약 개발을 위해 이 문제는 꼭 해결되어야 한다. 본 연구에서는 아이소자임을 구분하는 선택적 저해제를 개발하였다. 먼저 효소의 상보성으로 인한 펩타이드 기질들간의 활성도의 차이를 발견하였다. 그리고 상보성의 차이를 이용하여 다양한 종류의 저해제를 개발하였다. 리파아제의 활성자리는 주머니 구조와 소수성 표면로 구분되어 있어 기질 기반 저해제를 개발하는데 이상적이며 본 연구에서는 이를 토대로 리파아제의 저해제를 개발하였다. 리파아제에 상보적인 펩타이드를 찾아내기 위하여 펩타이드 기질을 합성하여 스크리닝한 결과 최적의 기질을 찾아내었다. 이 기질은 펩타이드가 없는 기질에 비하여 20 배 향상된 Km 값을 가짐을 확인하였다. 이 정보를 이용하여 합성된 3가지의 저해제들은 모두 높은 선택성과 마이크로몰 수준의 저해능을 갖고 있었다. 또한 리파아제에 대한 펩타이드 기질의 활성도들은 효소 활성도 지문을 제공하였으며 이 지문들간의 차이는 아이소자임들의 활성 자리 주변 구조가 상이함을 보여주었다. 특히 아미노산 서열이 매우 유사한 아이소자임의 경우 활성도의 차이를 나타내는 유클리디안 디스턴스 값이 더 크게 나타나는 유의미한 결과를 얻을 수 있었다. 이 전략은 아이소자임의 선택적 저해제를 합성하는데 사용될 수 있다.

While different types of enzymes can be easily discriminated because of their orthogonal substrates, differentiating isozymes is a very difficult task because their active site structures are nearly identical. This formidable problem, however, should be overcome to make side effect-free drugs against various therapeutic target enzymes. We generated selective inhibitors against isozymes using a systematic two-step process strategy. In the first step, we tried to find out somewhat different activities using various peptidyl substrates, because some of them reflect complementary of enzymes. In the second step, we synthesized many kinds of inhibitors using complementary information from the first step. Since two compartmental characters, deep pockets and hydrophobic surface of lipases, are very ideal for generating substrate-based inhibitor, we can use this strategy for generation of inhibitors of lipases. To uncover peptidyl complimentary against lipases, we synthesized and assayed peptidyl substrates and we were able to select substrates for various lipases. One of the best substrates against lipase from Chromobacterium viscosum showed 20-fold improved Km value relative to non-peptidyl butyrate. Using this complementary information, we could generate three selective inhibitors, against the cognate enzyme. All inhibitors showed keen selectivity with sub- to low-micromolar inhibition. Lipase activities using whole peptidyl substrates were represented as fingerprints. Differences in fingerprints of 8 individual lipases might reflect different structures near active sites of them. Differences in activity (represented as Euclidean distances) calculated from fingerprints are relatively large, in case where lipases have very similar amino acid sequence. Thus, this approach in general can be used for making selective inhibitors against isozymes.