약물 유발 mitochondrial dysfunction 간 독성 측정을 위한 실시간 단세포 이미징 cytometry

Abstract

신약 개발에 있어서 약물에 의한 기대되지 않는 부작용을 밝히는 것은 매우 중요하다. 간독성은 이런 부작용 중 하나로 주로 미토콘드리아 손상으로 인해 일어나는 경우가 많다. 본 연구에서는 약물에 의해 유발되는 미토콘드리아 손상으로 인한 간독성을 정량적 측정이 가능하고 실시간 측정이 가능한 단세포 이미지 시스템을 이용하여 스크리닝 할 수 있는 독창적인 방법을 제시한다. 다양한 파장대의 형광을 동시에 측정할 수 있는 AOTF(acousto-optic tunable filter)- 다파장 이미징 시스템을 이용하여 HepG2 세포 안의 intracellular calcium 농도의 증가, mitochondrial permeability transition(MPT) 현상의 발생과 caspase-3 활성 증가를 동시에 측정할 수 있는 시스템을 구축하였다. Intracellular calcium의 양, MPT 현상 발생과 caspase-3 활성을 측정하기 위해 각각 다른 파장의 형광이 표지 된 형광 다이(calcium indicator, calcein-AM, caspase-3 substrate)들을 HepG2 세포에 staining시켜 형광 현미경으로 측정하였다. 본 시스템을 이용하여 심각한 미토콘드리아 손상 간독성을 일으켜 시장에서 퇴출 된 약물인 nefazodone을 세포에 다양한 농도로 처리한 뒤 측정한 결과 세포독성의 초기 이벤트인 세포 내 칼슘의 증가, mitochondrial permeability transition 현상의 발생과 caspase-3의 활성 증가를 확인하였다. 기존 문헌에서 알려진 바와 같이 nefazodone에 의해 일어나는 간독성을 본 시스템을 이용하여 실시간으로 세 가지 이벤트를 동시에 확인 할 수 있었다. 또한 독성을 갖지 않는다고 알려진 dexamethasone을 처리하여 측정한 결과 세 가지 바이오 마커 모두 큰 변화를 보이지 않는 것을 확인하여 본 시스템의 정확성을 확인하였다. 본 연구는 관찰하고자 하는 세포 내 반응을 직접적, 정량적으로 측정 가능한 시스템을 개발한 것으로 간독성 및 세포 독성 측정에 있어서 신약 개발의 단계 중 초기단계에서 약물의 독성을 스크리닝 하는 방법으로 사용할 수 있을 것으로 기대된다.