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CMP-NeuAc 생성을 위한 다효소 고정화 방법의 개발 전략과 2-fucosyllactose의 생합성

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Authors

박일향

Advisor
김병기
Major
협동과정 바이오엔지니어링전공
Issue Date
2012-02
Publisher
서울대학교 대학원
Description
학위논문 (석사)-- 서울대학교 대학원 : 협동과정 바이오엔지니어링전공, 2012. 2. 김병기.
Abstract
본 연구는 바이러스 감염억제 및 면역강화로 알려진 sialyllactose와 fucosyllactose의 생합성 메커니즘을 통해 좀 더 효율적으로 합성하고자 수행하였다. Sialyllactose의 경우, 현재 존재하는 생합성 메커니즘을 토대로 효소 고정화 방법을 도입하여 대량생산에 대한 가능성을 도모하였으며, 2-fucosyllactose의 경우, salvage pathway(회수경로)를 통한 생합성 방법을 선택하여 기존에 존재하는 de novo pathway(신생합성경로)와는 또 다른 방법으로 생합성 될 수 있는 가능성을 보여주었다.
Sialyllactose의 생합성에 필요한 공여체 기질인 CMP-neuraminic acid(CMP-NeuAc)을 합성하기 위해서는 N-acetylglucosamine, CMP, ATP, pyruvic acid, acetyl phosphate의 5종류의 기질과 cytidylate kinase, acetate kinase, NeuAc aldolase, CMP-NeuAc synthease, glcNAc 2-epimerase의 5종류의 효소가 필요하다. 효소의 반복 사용을 통해 비용을 절감하고 효소의 효율적 사용을 도모하고자 고정화 방법을 적용해 보았다. 효소 고정화에 사용한 재료는 알긴산(alginate)비드, 실리카 코팅된 알긴산 비드, 키토산(chitosan)비드, 표면개질을 위한 아세틸화 키토산 비드를 다효소 고정화에 적용해보았다. 알긴산 비드의 경우, CMP-NeuAc을 합성하는데 필요한 기질 중 acetyl phosphate, CMP와 같은 음전하를 띄는 물질로 인해 반응하는 과정 동안 이온 결합으로 형성되어 있는 알긴산 비드의 물성이 유지되지 못하는 현상을 관찰할 수 있었다. 키토산 비드에 다효소를 고정화한 경우, CMP와 같은 기질이 흡착되는 문제점을 보였으나 키토산 비드의 표면에 존재하는 아민기를 차단하는 표면 개질을 통해 아세틸화 키토산 비드를 사용 할 경우 기질의 흡착을 줄일 수 있었고 동시에 기존의 키토산 비드에 비해 더 높은 재사용률을 얻을 수 있었다.
2-Fucosyllactose를 salvage pathway를 통해 생합성 하고자 L-fucokinase / GDP-L-fucose pyrophosphorylase (FKP)와 2-fucosyltransferase (2-FT)를 이용하였다. 2-FT의 경우, 활성이 알려진 균주는 많이 존재하지만 FKP와 사용된 연구와의 선례가 없었으므로 2-FT의 활성을 가진 균주를 확보하는 것이 우선적인 목표였다. 2-FT의 활성을 갖고 있는 균주를 CAZY사이트를 통해 조사한 결과, Helicobacter pylori 26695, Helicobacter pylori J99, Bacteroid fragilis 3688의 균주를 확보하였다. 세 가지 균주로 부터 얻은 2-FT의 활성이 가장 높았던 H. pylori 26695를 통해 2-FT의 염기서열의 최적화 및 발현조건의 최적화 및 샤페론과의 발현조건을 최적화한 결과 GroEL/ES 샤페론을 이용한 발현조건하에 IPTG 농도가 0.01 mM, 발현온도는 18℃일 때 세포 추출액으로의 단백질 발현율이 가장 높았음을 알 수 있었고, 반응조건에서의 2-FT의 수율 역시 증가함을 알 수 있었다. 또한 L-fucose로부터 연속 반응(One pot reaction)을 수행한 결과 12시간까지 50% 반응이 진행됨을 확인할 수 있었으며, 12시간 이후 반응이 더 이상 진행되지 않음을 확인할 수 있었다. 이를 통해 L-fucose로부터 2-fucosyllactose를 연속 반응을 통해 생산할 수 있음을 확인하였다.
Language
kor
URI
https://hdl.handle.net/10371/155882

http://dcollection.snu.ac.kr/jsp/common/DcLoOrgPer.jsp?sItemId=000000000462
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