ER stress에 의해 유발된 돌연변이 헌팅틴 단백질 응집 조절자로서의 IRE1 기능에 관한 연구

Abstract

Huntingtons disease (HD) is an inherited neurodegenerative disorder caused by an expansion of CAG repeats in huntingtin gene. The aggregation of mutant huntingtin (mtHTT) and striatal cell loss are representative features to cause uncontrolled movement, cognitive defect and psychiatric disturbance in HD. However, underlying mechanism of mtHTT aggregation and cell toxicity remains still elusive. Here, to find new genes modulating mtHTT aggregation, I performed cell-based functional screening using cDNA expression library and isolated IRE1 gene, one of ER stress sensors. Ectopic expression of IRE1 led to its self-activation and accumulated detergent-resistant mtHTT aggregates in human neuroblastoma SH-SY5Y, rat striatal AF5 and HEK293F cells. Treatment of neuronal cells with ER stress insults, tunicamycin and thapsigargin, increased mtHTT aggregation via IRE1 activation, while down-regulation of IRE1 expression using shRNA reduced ER stress-induced mtHTT aggregation. The kinase activity of IRE1, but not the endoribonuclease activity, was necessary to stimulate mtHTT aggregation and increased death of neuronal cells including SH-SY5Y and STHdhQ111/111 huntingtin knock-in striatal cells. Interestingly, ER stress impaired autophagy flux via IRE1-TRAF2 pathway, thus enhancing cellular accumulation of mtHTT. Atg5 deficiency in M5-7 cells increased mtHTT aggregation but blocked ER stress-induced mtHTT aggregation. Further, ER stress markers including p-IRE1 and autophagy markers such as p62 were up-regulated exclusively in the striatal tissues of HD mouse models and in HD patients. Moreover, down-regulation of IRE1 expression rescues the rough-eye phenotype by mtHTT in a HD fly model. These results suggest that IRE1 plays an essential role in ER stress-mediated aggregation of mtHTT via the inhibition of autophagy flux and thus neuronal toxicity of mtHTT aggregates in HD.

헌팅턴 병 (Huntingtons disease)은 유전성, 퇴행성 신경 질환으로, 자신이 의도하지 않은 움직임을 보이는 무도병(chorea), 우울증 같은 정신장애 및 치매 등의 증상을 나타낸다. 헌팅턴 병의 원인 유전자는 헌팅틴 (huntingtin) 유전자이며, 이 유전자의 염기서열 내에 CAG 반복 서열이 존재하는데, 이 반복서열의 증가가 발병 원인으로 알려져 있다. 헌팅턴 병의 대표적인 특징은 신경 세포 내 돌연변이 헌팅틴 단백질 응집 (aggregation)현상과 중뇌의 대뇌 기저핵 부위의 신경 세포의 소실이다. 이러한 특징을 바탕으로 헌팅턴 병의 치료제 개발을 위한 많은 연구가 이루어지고 있지만, 이 질병의 발병 기작은 여전히 잘 밝혀지지 않고 있다. 이 논문에서는, 헌팅턴 병의 특징인 돌연변이 헌팅틴 단백질 응집 현상을 조절하는 유전자를 찾고, 그 유전자가 헌팅턴 병의 발병 기작에 어떠한 역할을 하는지 규명하기 위한 실험을 하였다. 먼저, 돌연변이 헌팅틴 응집 현상을 증가시키는 유전자를 찾기 위해서, 1800 여개의 cDNA library pool을 이용하여 cell-based functional screening을 수행한 결과, IRE1 유전자가 돌연변이 헌팅틴 응집 증가에 매우 큰 효과를 보였기 때문에, 헌팅턴 병에 관련된 기능 연구를 진행하였다. IRE1은 세포 내 소포체에 존재하며, 소포체에서 ER stress가 발생했을 때, 이를 감지하여 신호를 내려 보내는 센서 단백질이다. IRE1이 신경 세포주인 AF5, SH-SY5Y, primary neuronal cell에서 과발현 되면, 돌연변이 헌팅틴 응집이 시간에 따라 증가되지만, 정상적인 헌팅틴 단백질의 응집은 일으키지 않는 특이성을 보였다. 또한 IRE1을 활성화 시키는 signal인 ER stress가 발생하면 돌연변이 헌팅틴 응집 현상이 증가하지만, shRNA를 이용하여 IRE1의 발현량을 감소시킨 세포에서는 ER stress에 의한 돌연변이 헌팅틴 응집 현상이 일어나지 않았다. 더욱이, ER stress를 인지하는 세 종류의 센서 단백질 중, IRE1에 의해서만 돌연변이 헌팅틴 단백질 응집 현상을 증가되는 현상을 관찰하였다. IRE1의 mutagenesis와 deletion mutants 제작을 통해서, ER stress에 의한 돌연변이 헌팅틴 응집 증가에 IRE의 kinase activity가 중요한 역할을 하는 것을 확인하였고, 이런 신호 전달은 dominant negative TRAF2의 발현에 의해 저해되는 것을 관찰함으로써 IRE1-TRAF2 pathway를 통해서 신호 전달이 이루어짐을 알 수 있었다. 세포 내에서 돌연변이 헌팅틴의 제거는 autophagy를 통해서 일어나는데, ER stress가 발생하면 IRE1 kinase activity를 통해서 IRE1-TRAF2 pathway가 autophagy activity를 저해하는 것을 관찰하였고, ER stress에 의해 autophagy activity가 감소함으로써 세포 내에 제거되지 못한 돌연변이 헌팅틴 응집이 증가되는 것을 보았다. 이렇게, IRE1의 통해서 일어나는 ER stress에 의한 돌연변이 헌팅틴 응집 증가는 신경 세포의 세포 사멸을 증가시켰고, shRNA를 이용하여 IRE1의 발현을 감소시키거나, dominant negative mutant 를 발현시켰을 경우 ER stress에 의한 세포사멸이 감소하는 것을 확인하였다. 또한, 헌팅턴 병의 모델 쥐와 헌팅턴 병 환자의 뇌에서 p-IRE1과 p62 단백질의 양이 증가되어 있는 것을 관찰함으로써 헌팅턴 병에서의 ER stress 증가와 autophagy activity 감소 사이의 생리학적 관련성을 확인하였다. 마지막으로, 헌팅턴 병 모델 초파리의 눈에서 보여지는 rough eye phenotype이 IRE1의 발현이 감소되면 완화되는 것으로 보아서 헌팅턴 병 발병 기작에서 IRE1의 기능이 중요한 역할을 할 것임을 유추할 수 있었다. 이러한 연구 결과를 바탕으로, cell-based functional screening을 통하여 돌연변이 헌팅턴 단백질 응집을 증가시키는 유전자들을 동정하였고, 그 중에서 IRE1이 ER stress에 의해 활성화되고 autophagy activity를 저해시켜서 돌연변이 헌팅틴 응집을 증가와 세포사멸을 유도하는 기작을 밝혔고, 이러한 기능 연구는 헌팅턴 병에서 ER stress와 autophagy 기능의 상관관계 파악하고 돌연변이 헌팅틴 응집 조절 기작 이해를 넓혔으며, 나아가 ER stress 조절을 통한 헌팅턴 병의 치료제 개발의 가능성을 제시하였다.