A study of the expression pattern and function of HSP47 in esophageal squamous cell carcinoma

Abstract

Introduction : In Korea, esophageal cancer is one of the most fatal cancers and favorable clinical outcome can be expected only when radical resection is accomplished in the early stage. There have been rarely successful treatment strategies, so researchers have tried to find diagnostic or therapeutic molecular targets for this cancer. The purpose of this study is to investigate the function of the candidate of target molecule screened by genetic profiling of esophageal squamous cell carcinoma. In the preliminary experiments, 47-kDa heat shock protein (HSP47) was identified by genetic profiling using microarray and its expression was confirmed by reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR) and western blot. HSP47 is a collagen-binding stress protein and functions as a chaperone stabilizing the structure of nascent collagen chains. However, in some tumors, HSP47 is expressed independent of its chaperone properties and manifests on the cell surface. HSP47 has been found to be overexpressed in pancreatic cancer, osteosarcoma, and lung cancer. In squamous cell carcinoma of the head and neck, HSP47 locus (11q13.5) is known to be frequently overexpressed and HSP47 has been suggested as a target protein for the targeted delivery of anticancer agent. Change of HSP47 expression in malignant diseases is well known, but there are no articles dealing with gene expression and function of HSP47 in esophageal squamous cell carcinoma. The purpose of this study is to evaluate function of HSP47 using HSP47 knock-downed cell lines and immunohistochemical staining. Materials and Methods : To analyze biological functions of the HSP47 expression, the TE-8 cell line (Tohoku University) was used for knock-down of HSP47. For transfection, HSP 47 siRNA (h): sc-35600 and Lipofectamine™ 2000 was used and combined by incubation. These siRNA-Lipofectamine™ 2000 complexes were added directly to each well containing cells and mixed. This mixture was incubated for 48 hours at 37℃ in a CO2 incubator. Knock down of HSP47 was confirmed by a semiquantitative RT-PCR. Proliferation assay procedures were performed to evaluate the influence of HSP47 on proliferation and migration. A wound healing assay was used for comparing proliferating power. An 3,4,5- dimethylthiazol-2-yl -2-5-diphenyltetrazolium bromide (MTT) colorimetric assay was used for determining viable cell number in proliferation. After performing a cell culture, MTT was added on culture media and these two cell lines were cultured again. The amount of formazan absorbed by cells was measured by enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) reader at a wavelength of 560nm. The TE-8 cell line and HSP47 knock-down TE-8 cell line were treated with cis-platin and 5-fluorouracil (5-FU) and the rate of apoptosis was analyzed and compared by flow cytometry. The DNA content was measured by fluorescence-activated cell sorting (FACS) flow cytometer and the cell cycle distribution was calculated automatically. Paraffin blocks of surgical specimens were obtained from 158 patients who underwent curative surgical resection for esophageal squamous cell carcinoma from 1999 to 2006 at the Korea Cancer Center Hospital. A tissue microarray technique is used for immunohistochemical staining. After immunohistochemical staining, each specimen was scored semi-quantitatively according to the intensity and the number of stained tumor cells on a 3-point scale. The grade of IHCS and other clinical variables including sex, age, postoperative T, N, M stage, differentiation were analyzed using the Cox-proportional Hazard model. Results : The knock downing of HSP47 was confirmed by a semi-quantitative RT-PCR. The immunohistochemical staining grade and other clinical variables were analyzed. A multivariate analysis revealed that IHCS grade was the significant prognostic factor independent of TNM stage group. Patient in the IHCS grade 2 group had a worse prognosis and worse recurrence-free survival rate than the IHCS grade 0 and 1 groups, but only overall survival rate was significantly different. In the MTT assay, the HSP47-KD TE-8 cell line showed significantly lower proliferating power. The cell cycle properties and apoptosis of esophageal squamous cell carcinoma was not influenced by the HSP47. Conclusion : In this study, the expression level of HSP47 was associated with proliferating power and prognosis of esophageal squamous cell carcinoma. HSP47-labeled fibroblasts and stroma have characterically been seen around infiltrating neoplastic glands in pancreatic ductal carcinoma. Proliferating power is a main feature of the local progression of tumors, so a higher level of HSP47 expression may correlate to the prognosis. HSP47 is known to be useful as a target for immunotherapy, a target for gene therapy or a immunoconjugate form of chemotherapeutic agent. Since the HSP47 is expressed on the cell surface in cancers and easily supressed by agents such as cartilage-selenium or HSP antisense oligonucleotide, it is worth further study regarding its mechanism of action in cancer tissue.

연구배경 : 식도암은 가장 치명적인 암종의 하나로 조기발견하여 근치적 절제술을 시행받는 경우가 아니면 좋은 치료 결과를 기대하기 힘들다. 아직까지는 성공적인 치료전략이 없어서, 많은 연구자들이 식도암의 진단과 치료목적으로 분자생물학적 종양표지자를 발굴하고자 노력하였다. 이 연구의 목표는 식도의 편평상피세포암에서 스크린된 분자생물학적 표지자인 HSP47의 기능을 조사하는 것이다. HSP47의 발현을 마이크로어레이, RT-PCR과 western blot을 통해서 확인하였다. HSP47은 스트레스로 유도되며, collagen의 초기 단백질 사슬의 구조안정화에 작용하는 기능을 한다. 그러나 어떤 종양에서는 이러한 정상적인 기능과 관계없이 세포표면에서 발현된다. 췌장암, 골육종, 두경부암 그리고 폐암에서 HSP47이 과발현되는 현상이 발견되었다. 이러한 악성종양에서의 HSP47의 발현양상의 변화에 대한 많은 보고들이 있지만 아직까지는 식도암에서의 연구 보고는 없는 상황이다. 이번 연구에서는 HSP47가 억제된 세포주 실험과 면역형광염색등의 방법을 통해 HSP47의 기능을 분석하고자 한다. 연구대상 및 방법 : HSP47 유전자 조작실험을 위하여 TE-8 세포주가 사용되었다. HSP 47 siRNA와 Lipofectamine™ 2000을 배양하여 결합시키고, 이 결합체를 세포주가 담긴 용기에 첨가한다. 이것을 48시간동안 37℃로 CO2배양기에서 배양한다. 유전자조가 억제된 것은 RT-PCR로 확인한다. HSP47에 대한 증식능력 분석은 wound healing assay와 MTT분석으로 하였다. 세포주를 배양하고 거기에 MTT를 첨가하여 다시 배양한다. 세포주에 흡수된 formazan의 양은 560nm에서 ELISA 측정기로 측정한다. TE-8 세포주와 HSP47이 억제된 세포주에 cis-platin과 5-FU을 처리한 뒤에 자가사멸 유도한 뒤에 이 양상을 flow cytometry를 통해서 분석한다. FACS flow cytometry를 이용하여 DNA의 양을 분석하고 세포주기의 분포를 평가한다. 파라핀블록은 1999년부터 2006년까지 원자력병원에서 식도의 편평상피세포암으로 근치적 절제술을 받은 158명의 환자의 조직 표본을 사용하였다. 이들 표본에 대해 tissue array 기술을 사용하여 면역형광염색을 실시하였다. 그 결과는 염색강도와 염색된 종양세포의 숫자에 따라서 3단계의 등급으로 분류하였고, 성별, 연령, T, N, M 병기와 분화도 등의 다른 임상변수와 함께 Cox-proportional hazard model을 이용한 방법으로 분석되었다. 연구결과 : HSP47 유전자 억제는 semi-quantitative RT-PCR로 확인되었다. 면역형광염색결과에 대한 다변량분석을 통해서 면역형관염색결과가 TNM병기와 무관하게 예후에 영향을 미치는 것으로 나타났다. Grade 2의 환자군이 grade 0, 1의 환자군에 비하여 예후가 좋지 않았다. 또 Grade 2의 무병생존기간도 짧은 것으로 나타났으나 이는 통계학적으로 유의하지는 않았다. MTT분석 결과, HSP47가 억제된 세포주는 증식능력이 유의하게 약화된 것으로 나타났다. 식도의 편평상피세포암의 자가사멸은 HSP47에 의하여 영향을 받지 않았다. 결론 : 이번 연구에서 HSP47의 발현정도는 식도 편평상피세포암의 증식능력과 예후에 관련이 있는 것으로 생각된다. HSP47의 과발현은 많은 악성종양에서 보고되고 있다. 췌장암의 경우 침습적인 암종주위로 HSP47로 표지되는 섬유아세포와 간질조직들이 관찰된다. 암의 증식능력은 국소적인 진행의 중요한 요소이기 때문에, HSP47의 발현이 예후와 관련이 있을 수 있다. Collagen type I과 type VII은 식도암의 예후인자로서, 침습성 및 불량한 예후와 관련이 있다. 이러한 결과도 HSP47이 식도 편평상피세포암의 예후와의 관련성을 설명할 수 있다. HSP47은 세포표면에서 발현되고, 연골-셀레늄이나 HSP을 억제하는 oligonucleotide 등에 의하여 기능이 억제될 수 있기 때문에 잠재적으로 좋은 치료표적이 될 수 있다. 이는 항암제와 항체의 결합체로서, 면역치료제로서, 또는 adenovirus를 이용한 면역치료의 표적으로서 활용가능하다. 이러한 HSP47의 기능과 특성을 감안하면, 향후 진단 및 치료목적의 활용을 위한 추가적인 연구대상으로서의 가치가 있다.