Novel Guggulsterone Derivative GG-52 Inhibits NF-κB Signaling in Bone Marrow Derived Dendritice Cells and Attenuates Colitis of IL-10 Deficient Mice

Abstract

We already demonstrated that one of guggulsterone derivatives, guggulsterone-52 (GG-52) inhibited the activated nuclear factor-kappaB (NF-κB) signals in intestinal epithelial cells and had preventive and therapeutic effect on dextran sulfate sodium-induced colitis. This study investigates the anti-inflammatory effects of GG-52 on bone marrow derived dendritic cells and colitis in interleukin-10 deficient mice. Bone marrow derived dendritic cells (BMDC) were generated from femur of C57BL/6 and IL-10–/– mice with murine recombinant GM-CSF and IL-4 sorted by CD11c+ and CD11b+. BMDCs were stimulated with lipopolysaccharide (LPS) with or without GG-52. The effect of GG-52 on NF- κB signaling in BMDC were examined by interleukin-12p40 (IL-12p40) and tumor necrosis factor-alpha (TNF-α) real-time reverse-transcription polymerase chain reaction, western blotting for IκBα phosphorylation, and electrophoretic mobility shift assay (EMSA). For in vivo study, IL-10 deficient mice were fed piroxicam with or without GG-52. Colitis was quantified by evaluation of microscopic findings and double immunofluorescence staining for CD11c and IKK-α. GG-52 significantly inhibited the activated LPS- induced IL-12p40 and TNF-α gene expression, NF-κB DNA binding activity in BMDCs stimulated with LPS. Moreover, pretreatment with GG-52 attenuated the increased IκB kinase (IKK) and IκBα phosphorylation induced by LPS. In colitis model of IL-10 knockout mice, administration of GG-52 significantly reduced the severity of piroxicam-enhaced colitis, as assessed by histology and suppressed IKK-α activation in dendritic cells on intestinal epithelium. These results indicate that the novel guggulsterone derivative GG-52 blocks NF- κB activation in bone marrow derived dendritic cells and ameliorates piroxicam-enhanced chronic colitis in IL-10 knockout mice, which suggesting that GG-52 is a potential therapeutic agent for a treatment of inflammatory bowel diseases.

만성 염증성 장질환은 장내 세균에 대한 과도한 면역반응에 의해 발생하는 만성적인 위장관의 염증성 질환이다. 기존의 치료제인 스테로이드 제제나 강력한 면역 억제제들은 만성 염증성 장질환에 흔하게 쓰이고 있으나 이들 제제가 가지고 있는 부작용으로 인해 장기간 사용할 경우 심각한 합병증을 초래하는 경우가 많다. 따라서 부작용이 많지 않으면서도 장의 염증을 효과적으로 억제할 수 있는 제제의 개발이 절실한 상황이다. 구글스테론은 고대 인도의학에서 많이 쓰이던 Commiphora mukkul이라는 허브에서 추출한 식물성 스테롤의 일종으로 항염증 효과, 종양 억제 효과 및 지질대사에 영향을 주는 등 다양한 약리 작용을 가진 약물이다. 이의 유도체인 GG-52는 전신 흡수를 줄여 장관에 높은 농도를 부작용의 우려 없이 투여할 수 있는 제제로 최근 연구에서 장상피 세포에서 NF-κB 신호 전달을 억제하며 DSS에 의한 급성 장염에서 장염 완화 효과를 가짐이 알려졌다. 본 연구는 GG-52가 만성 장염 모델인 IL-10 유전자 제거 쥐에서 발생하는 장염에도 효과가 있는 지를 살펴보고 이의 기전으로 골수 유도 수지상 세포에서 NF-κB 신호 전달 억제 여부를 확인하고 이를 in vivo에서 이중 면역형광 염색을 통해 확인하고자 하였다. 골수 유도 수지상 세포는 IL-10 유전자제거 쥐와 C57/BL6 쥐의 대퇴골에서 골수를 추출한 뒤 쥐 GM-CSF와 IL-4가 섞인 배지에서 일주일간 배양하여 유도하였다. 골수 유도 수지상 세포를 지다당류(lipopolysaccharide)로 자극을 하였을 때 GG-52를 전처치 한 군에서 IL-12p40와 TNF-α와 같은 염증성 싸이토카인들의 발현이 감소하였다. GG-52를 투여한 골수 유도 수지상 세포에서 지다당류로 자극 시 Immunoblot으로 IκB의 분해가 억제됨과 EMSA로 NF-κB의 DNA 결합이 억제됨을 확인하여 GG-52가 NF-κB 신호 전달을 억제함을 알 수 있었다. IL-10 제거 생쥐를 이용한 만성 장염 모델에서 GG-52를 2주간 투여하였을 때 만성 장염을 유의하게 호전시켰고 장염 조직에 대한 이중 면역 형광 염색에서 GG-52를 투여군의 장상피에서 NF-κB 신호가 활성화된 수지상 세포의 숫자가 감소하였다. 본 연구는 GG-52 제제가 골수 유도 수지상 세포에서 NF-κB 신호전달을 억제하고 이 작용으로 IL-10 유전자제거 생쥐에서 만성 장염을 완화시킬 수 있음을 증명한 최초의 연구로 in vivo에서도 수지상 세포의 NF-κB의 활성화 억제를 보여주었다는 점에서 의의를 가진다. 향후 본 연구의 방법론과 결과를 토대로 만성 염증성 장질환 모델에서 다양한 염증 세포들에 대한 GG-52의 작용을 확인한다면 GG-52를 효과적인 만성 염증성 장질환 치료제로서 응용할 수 있을 것으로 기대된다.