The role of ABH antigens in human keratinocyte

Abstract

Glycosylation is common post-translational modifications of protein, which regulates the stabilities, activities, ligand affinities, and solubilities of target proteins. Most cell surface and secretory proteins are known to be glycosylated. ABH antigens, determinants of the ABO blood group system, are one of the most well-known glycans. A and B antigen consist of six monosaccharides with biantennary structure, which differ from one terminal sugar unit. In contrast, H antigen is the precursor glycan of A and B antigen with five monosaccharides. Even though they were firstly discovered in red blood cells, many other organs express ABH antigens, especially in epithelium such as gastrointestinal tract, respiratory tract, urinary tract and skin. However, the physiological role of ABH antigens is still opaque. Several clinical researches have reported that abnormal ABH antigen expressions are correlated with tumor metastasis. Also, some pathogens such as Helicobacter pylori and Plasmodium falciparum utilize ABH antigens for their infections to hosts. However, these researches do not reveal the function of ABH antigens themselvs. Skin is the largest organ in the body, which serves as a physical and permeable barrier against external environments. ABH antigens are also expressed in epidermis; A and B antigen are expressed in granular layer, the outmost layer in epidermis, whereas H antigen is expressed in spinous layer. In this respect, we expected that ABH antigens may affect the barrier function of epidermis. In chapter I, we established a method to inhibit the expression of ABH antigens specifically. At the same time, we examined which proteins in keratinocytes were conjugated with ABH antigens to find a clue of the physiological role of these antigens. We utilized HaCaT cell, an immortalized keratinocyte cell line expressing B antigen, in this research, since primary keratinocytes did not expressed any of ABH antigens. We suppressed the B antigens expression by transfecting a siRNA for α1,2-fucosyltransferase-1 (FUT1), which mediates H antigen and lewis antigens synthesis. However, we found that only B antigen was suppressed by FUT1 siRNA transfection. Immunoprecipitation (IP) analysis using anti-B antigen antibody and Liquid Chromatography (LC)/Mass Spectrometry (MS)/MS analysis analysis revealed that several proteins were expected to be conjugated with B antigen. Among them, we confirmed that epidermal growth factor receptor (EGFR), desmoglein-2, α6 and β1 integrin were actually conjugated with B antigen. Therefore, we focus on the influence of B antigen on the function of these proteins. In chapter II, we investigated the role of B antigen in HaCaT cell migration, since integrins modulate the haptotactic migration toward extracellular matrix (ECM). Transwell migration assay showed that both knock-down of B antigen expression and the neutralization of B antigen inhibited HaCaT cell migration toward collagen-1 (COL-1). The expression of collagen receptor, α2β1 integrin, was not affected by FUT1 siRNA transfection. However, knock-down of FUT1 enhanced rather than decreased HaCaT cell adhesion on COL-1. Thus we expected that other migration mechanisms, irrelevant to the action of integrin, were regulated by B antigen. In vitro wound assay showed that knock-down of B antigen decreased HaCaT cell migration, lamellipodia protrusion and actin polymerization. Also, the transcription of cdc42, an important small-GTPase in actin polymerization, was inhibited by suppression of B antigen. In addition, the interaction between cdc42 and neural Wiskott–Aldrich Syndrome protein (N-WASP), which promotes actin polymerization, decreased in FUT1 knocked-down groups. Therefore, we concluded that B antigen modulated HaCaT cell migration through the transcriptional regulation of cdc42 and the actin polymerization pathway. In chapter III, we investigated the role of B antigen in the apoptosis of HaCaT cell. Knock-down of B antigen enhanced serum-starvation induced cell death. We observed that apoptosis signaling pathway was activated by suppression of B antigen expression. We also found that transfection of FUT1 siRNA increased the intracellular reactive oxygen species (ROS) level. However, treatment of NAC, a ROS scavenger, failed to suppress apoptosis signaling pathway. We further examined that which apoptosis signaling pathway was activated by knock-down of B antigen expression. As a result, transfection of FUT1 siRNA activated the extrinsic apoptosis pathway during serum starvation. We also found that suppression of B antigen enhanced the apoptosis signal pathway induced by tumor necrosis factor-alpha (TNF-α). Therefore, we concluded that B antigen inhibited the apoptosis of HaCaT cell by suppressing the activity of death receptors. In summary, B antigen up-regulated the transcription of cdc42 and the actin polymerization pathway, which promoted HaCaT cell migration. In addition, B antigen inhibited the apoptosis of HaCaT cell through the suppression of extrinsic apoptosis pathway.

Glycosylation은 빈번하게 일어나는 post-translational modification의 한 과정으로, 단백질의 활성, 안정성, 리간드 특이성, 수용성을 조절한다. 대부분의 세포막 단백질과 분비 단백질들은 glycosylation의 대상으로 알려져 있다. 이러한 glycosylation 중에 가장 유명한 것은 ABO 혈액형을 결정하는 ABH 항원이다. A와 B 항원은 6개의 당이 bi-antennary 구조로 배열되어 있으며, A 항원은 마지막 당이 N-acetyl-galactosamine, B 항원은 galacose인 차이를 가지고 있다. H 항원의 경우, A와 B항원의 전구체로 5개의 당으로 구성되어 있다. ABH항원은 최초로 적혈구에서 발견되었지만, 다른 여러 기관에서도 이 항원을 발현한다. 특히, gastrointestinal tract, respiratory tract, urinary tract, 피부와 같은 상피 조직에서 많이 발현된다. 하지만, 아직까지 ABH 항원의 기능에 대해서는 알려진 바가 거의 없을 뿐만 아니라, A, B, H 각 항원 간의 기능 차이도 알려져 있지 않다. 종양 진행 과정에서 ABH 항원의 발현 변화가 관찰되는 임상 연구가 보고 되어 있으며, Helicobacter pylori와 Plasmodium falciparum 등의 감염에 ABH 항원이 이용된다는 연구 결과가 있다. 하지만, 이러한 연구 결과는 ABH 항원 자체의 기능을 밝히지는 못했다. 피부는 인체 내의 가장 큰 기관으로써, 외부 환경에 대한 인체 장벽으로 작용한다. 피부 표피 조직에서도 ABH 항원이 발현되는데, A와 B 항원은 가장 바깥 층인 granular layer에서, H 항원은 spinous layer에서 각각 발현된다. 따라서 피부의 장벽 기능에 ABH 항원이 영향을 줄 것이라는 예상을 할 수 있다. 본 연구는 이러한 관점에서 ABH 항원의 피부에서의 기능에 대해 연구를 진행하였다. 제 1장에서는 각질 형성 세포에서 어떠한 단백질이 ABH 항원과 결합되어 있는지 알아봄으로써, 이들 단백질의 기능에 ABH 항원이 영향을 미치는 지 단서를 찾아보았다. 하지만, 1차 각질 형성 세포에서는 ABH 항원이 발현되지 않는 것을 확인하였다. 그와 반면, 각질 형성 세포주인 A431과 HaCaT 세포에서는 각각 A 항원과 B 항원이 발현되었다. 이 두 세포 중에서, 각질 형성 세포의 기능에 널리 사용되는 HaCaT 세포를 대상으로 어떠한 단백질이 ABH 항원과 결합되어 있는 지를 연구하였다. B 항원의 발현을 억제하기 위해서 H 항원을 합성하는 FUT1 당 전이 효소에 대한 siRNA를 처리하였다. FUT1은 ABH 항원의 합성뿐만 아니라, 이들과 구조적으로 유사한 lewis 항원들을 합성하는데도 관여한다. 하지만, HaCaT 세포에서는 lewis 항원들이 발현되지 않거나, FUT1 siRNA 처리에 의해서 발현이 영향을 받지 않았다. HaCaT 세포에서 어떠한 단백질이 B 항원과 결합되어 있는지를 B 항원에 대한 항체로 immunoprecipitation한 후 LC/MS/MS로 확인하였을 때, 여러 단백질들이 검출되었다. 그 중에서 면역 형광 염색 결과를 고려하여 세포막에 존재하는 단백질들을 대상으로 IP를 한 후 B 항원과 실제로 결합하였는지 확인해보았다. 그 결과, EGFR, desmoglein-2, α6와 β1 integrin이 B 항원과 결합되어 있음이 확인되었다. 제 2장에서는 HaCaT 세포의 이동에 B 항원이 영향을 미치는 지 확인해 보았다. 제 1장의 결과에서 integrin이 B 항원과 결합되어 있었기 때문에, integrin의 기능인 ECM을 인지하는 기능에 어떠한 영향을 미치는지 transwell chamber assay를 통해 연구하였다. 그 결과 FUT1 siRNA를 처리한 군에서 콜라겐-1에 대한 HaCaT 세포의 이동이 억제되어 있는 것을 확인하였다. 또한 HaCaT 세포에 항체를 처리하여 B 항원을 중성화시켰을 때도 동일하게 콜라겐-1에 대한 이동이 억제되었다. 하지만, 콜라겐에 대한 수용체인 α2β1 integrin의 발현에는 B 항원이 영향을 미치지 않았으며, cell adhesion assay에서는 오히려 FUT1 siRNA를 처리하였을 때 콜라겐-1에 대한 achesion이 증가하였다. 따라서 integrin의 기능과 무관한 다른 세포 이동 기전이 B 항원의 발현에 의해 조절 받는 것으로 예측이 되었고, 이를 확인하기 위해 in vitro wound assay를 진행하였다. 그 결과 FUT1 siRNA를 처리한 군에서 세포 이동이 억제되는 것을 관찰하였다. 또한 이동하는 세포의 특징적인 구조인 lamellipodia 형성과 actin filament의 형성이 FUT1 siRNA를 처리하였을 때 감소하는 것을 확인하였다. 이러한 actin polymerization에 관여하는 것으로 알려진 cdc42의 발현이 FUT1 siRNA를 처리하였을 때 전사 단계에서 감소되는 것을 확인하였다. 또한, actin polymerization의 주요 기전인 cdc42와 N-WASP의 결합이 FUT1 siRNA에 의해 억제되었다. 따라서 B 항원의 발현이 cdc42의 전사를 유도하고, actin polymerization 신호 전달 경로를 활성화하여 세포의 이동을 촉진함을 밝혔다. 제 3장에서는 HaCaT 세포 사멸에 B 항원이 어떠한 영향을 미치는지 알아보았다. FUT1 siRNA를 처리한 군에서 serum-starvation시에 죽은 세포가 증가하는 것을 확인하였고, 이 현상은 세포 사멸 과정을 통해 일어남을 확인하였다. 또한 세포 사멸 신호 전달 경로인 caspase-3와 PARP의 분할이 FUT1 siRNA 처리 시에 증가하였고, 세포 사멸을 억제하는 phospho-Bad 역시 감소하였다. 하지만 Bad를 인산화하는 상위 신호 단백질인 ERK는 오히려 활성화되었다. 세포 내 활성 산소종이 증가하면 세포 사멸을 증가시키며 동시에 ERK를 활성화시키는 것으로 알려졌기 때문에, B 항원의 발현을 억제하면 활성 산소종이 증가하지 않을까 추정하였다. 실제로 FUT1 siRNA를 처리한 군에서 활성 산소종이 증가하였다. 하지만 이들을 NAC를 처리하여 제거하였을 때, caspase-3나 PARP의 분할을 억제하지 않았다. B 항원이 어떠한 세포 사멸 기전을 조절하는지 알아보기 위해 caspase-8과 caspase-9의 분할을 관찰하였다. 그 결과 extrinsic pathway에 포함되는 caspase-8의 활성화가 관찰되었고, 그 상위 단백질인 FADD의 phosphorylation이 증가되어 있었다. Extrinsic pathway는 death receptor들에 의해 활성화 되는데, TNF-α 처리에 의한 세포 사멸 신호 기전이 FUT1 siRNA를 처리한 군에서 더욱 증가하였다. 따라서, B 항원은 death receptor의 활성을 억제하여 세포 사멸을 감소하는 것으로 확인되었다. 요약하면, B 항원은 HaCaT 세포의 cdc42의 발현을 증가시키고, actin polymerization 신호 전달 기전을 촉진함으로써, 상처 치료 과정에 중요한 세포 이동을 증가시킨다. 또한, B 항원은 HaCaT 세포의 death receptor를 억제함으로써, 세포 사멸을 감소시킨다.