생쥐 난자의 유리화 동결 중 항동결 단백질의 첨가효과에 대한 연구

Abstract

Antifreeze proteins (AFPs) are a class of polypeptides produced by Antarctic fish which permit their survival in subzero environments. The purpose of this study was to investigate the effect of AFP supplementation during mouse oocyte vitrification on the survival, fertilization and subsequent embryonic development. In-vivo matured MII oocytes obtained from four to six week-old female BDF-1 mice were vitrified using a two-step exposure to equilibrium and vitrification solution. Equilibrium solution was 7.5% ethylene glycol (EG), 7.5% propanediol (PROH) and vitrification solution was composed of 15% EG, 15% PROH and 0.5 M sucrose. All solutions were based on TCM 199 containing 20% FBS with or without AFP III (500 ng/ml). After exposure to two solutions, oocytes were transferred to CryoTop and immediately plunged into liquid nitrogen. One week later, the oocytes were warmed and then fertilized by using epididymal sperms. Subsequent embryo development was assessed up to blastocyst formation. Through immunostaining of vitrified-warmed oocytes, morphology of spindle and chromosome was assessed. Membrane integrity, ATP contents, and several gene expressions were also analyzed. In AFP supplementation group, blastocyst formation rate was significantly higher (94.0% vs. 85.6%) and DNA fragmentation rate of blastocyst was significantly lower (4.9% vs. 7.3%) when compared with non-treated group. A higher rate of intact spindle/chromosome configuration (85.2% vs. 71.6%) and more stable membrane state (91.1% vs. 80.0%) was noted in AFP-treated group. ATP content within oocyte was significantly higher in AFP-treated group. AFP-treated group demonstrated a higher Mad2 and lower Eg5 gene expression compared with non-treated group. Both vitrification groups showed increased Hsf1 and Zar1 expression and decreased Hook1 expression when compared with fresh control. Both vitrification groups also showed decreased Zp3 and increased Zp1/Zp2 expression when compared with fresh control. In conclusion, we demonstrated for the first time that supplementation of AFP into vitrification medium has protective effect of mouse oocyte from chilling injury: it can preserve integrity of spindle and membrane, and intracellular ATP contents. More stable spindle integrity in AFP-treated group appears to be associated with a higher Mad2 and lower Eg5 gene expression.

항동결 단백질은 영하의 온도 환경속에서 생존할 수 있는 남극의 동식물에 의해 생산되는 폴리펩티드들 중에 하나이다. 이 단백질은 남극이나 북극에 사는 동물과 식물들의 조직에서 흔히 발견된다. 본 논문의 연구 목적은 생쥐의 난자를 초급성 유리화 동결법을 이용해 동결보존을 시행하고 이 때 항동결 단백질을 동결 보존액에 적정 농도로 첨가 시 생쥐난자의 생존률, 수정률, 그리고 연속적인 배아의 발달능에 어떤 긍정적인 효과를 보이는지 알아보기 위해서 실험을 진행하였다. 배란 유도제에 의해 체내에서 성숙된 성숙단계 난자 (In-vivo matured metaphase II oocyte)는 4주령에서 6주령의 BDF-1 생쥐를 이용하여 얻었다. 얻은 난자를 두 가지 단계의 평형동결액과 동결보존액에 각각 노출 시킨 후 초급성 유리화 동결법을 이용해 난자를 동결보존하였다. 평형동결액은 기본 배지에 최종 농도 7.5%의 에틸렌 글리콜, 그리고 7.5%의 프로파니디올을 첨가하여 제조하였다. 동결보존액은 기본 배지에 최종 농도 15%의 에틸렌 글리콜, 15%의 프로파니디올, 그리고 0.5M의 슈크로즈를 첨가하여 제조하였다. 상기 두 가지 용액은 TCM-199에 FBS를 20%가 되게 섞어 만든 용액을 기본 배지로 사용하여 각각 제조되었고 항동결 단백질을 500ng/ml 첨가하거나 하지 않은 용액을 사용하여 실험을 진행하였다. 두 가지 용액에 노출 시킨 후 난자는 CryoTop에 옮기고 그 즉시 액체 질소에 넣어 동결시켰다. 일주일 후 난자는 해동 과정을 거쳐 한 시간 동안 37도 배양기에 배양되었고 그 다음 정자를 주입해 체외 수정을 시켰다. 배 발달은 배반포 형성 시기까지 관찰하였다. 면역염색 과정을 통하여 동결 해동 난자는 방추사와 염색체의 배열을 평가하였다. 또한 막의 안정성과 세포내 ATP의 보존량에 대해서도 평가하였다. 마지막으로 여러 유전자 발현도 역시 분석하였다. 항동결 단백질 첨가 군에서 배반포 형성률은 대조군에 비해 통계적으로 유의하게 높게 나타났고 (94.0% vs. 85.6%) 배반포의 세포질의 caspase 발현률은 현저하게 낮았다 (4.9% vs. 7.3%). 정상적인 방추사와 염색체 배열은 실험군에서 더욱 높게 나타났고 (91.1% vs. 80.0%) ATP도 실험군에서 높은 비율로 보존 되었다. 항동결 단백질을 포함한 실험군에서 첨가하지 않은 대조군에 비해 증가된 Mad2와 감소된 Eg5 유전자 발현패턴을 보였다. 동결 해동한 두 군에서는 얼리지 않은 대조군에 비해 증가된 Hsf1과 Zar1 발현을 보였고 감소된 Hook1의 발현을 나타냈다. 게다가 동결 해동한 두 군에서는 얼리지 않은 대조군에 비해 감소된 Zp3와 증가된 Zp1/Zp2 발현 패턴을 나타냈다. 결론적으로 본 실험자는 최초로 항동결 단백질을 동결보존액에 넣어서 그 효과를 입증했으며 생쥐 난자를 동결 상해로부터 보호할 수 있었다. 항동결 단백질을 동결 시 적정농도로 첨가함으로써 방추사, 세포막 보존성, 그리고 세포질 내 ATP 보존을 크게 향상시킬 수 있었다. 동결 해동한 대조군에 비해 실험군에서 더욱 안정된 방추사의 결과는 높은 Mad2와 낮은 Eg5의 유전자 발현들과 연관되어 있다고 추정된다.