Effect of Dlx3 and Dlx5 on Adipogenic

Abstract

Dlx3는 Dlx homeobox 전사인자의 하나로 Tricho-dento-osseous(TDO) 증후군의 원인유전자이다. TDO 환자에서 골밀도 증가가 관찰되지만 그 기전은 아직 명확하지 않다. 골수 줄기세포에서 조골세포 또는 지방세포로의 분화는 서로 상반된 조절을 받는 것으로 알려져 있으므로 지방세포 분화 저해인자는 조골세포 분화를 촉진하여 골량 증가를 유도할 가능성이 있다. Dlx3 및 이와 유사한 구조를 가지고 있는 또 다른 전사인자인 Dlx5는 조골세포 분화 촉진 작용은 잘 알려져 있으나 지방세포 분화에 대한 조절 효과는 아직 보고된 바 없다. 따라서 본 논문에서는 Dlx3 및 Dlx5에 의한 지방세포 분화 조절 효과 및 그 기전을 규명하고, 야생형과 TDO 돌연변이형 DLX3 간 지방세포 분화 억제능의 차이가 나타나는 기전을 규명하고자 하였다. 본 논문의 전반부에서는 TDO 증후군 환자에서 관찰되는 돌연변이형 DLX3(4 bp DEL, NT3198)와 야생형 DLX3 사이에 지방세포 분화 조절능력의 차이가 있는지에 관한 연구 결과를 기술하였다. 사람 골수 줄기세포와 3T3-L1 지방전구세포에 야생형 및 돌연변이형 DLX3를 과발현한 결과 모두 지방세포 분화를 억제하는 효과를 보였으나 야생형에 비해 TDO 돌연변이형 DLX3가 더 강력한 억제효과를 나타내었다. 지방세포 분화과정에 DLX3의 기능을 확인하고자 3T3-L1 세포의 지방세포 분화과정 중 Dlx3 발현수준을 확인한 결과 지방세포 분화가 유도되면 Dlx3 발현이 감소됨이 확인되었다. 또한 Dlx3 siRNA를 이용하여 Dlx3의 발현을 저해한 경우 3T3-L1 세포의 지방세포 분화가 현저히 촉진되었다. DLX3가 지방세포 분화를 저해하는 기전을 확인하고자 DLX3에 의해 발현이 현저히 억제된 PPAR를 과발현시킨 경우 DLX3에 의한 지방세포 분화 억제효과가 소실되었다. DLX3가 PPAR 전사를 감소시키는 기전을 확인한 결과 DLX3가 프로모터에 직접 결합하는 대신 PPAR 전사 촉진인자인 C/EBP와 DLX3가 결합하여 C/EBP의 PPAR 프로모터 결합을 저해함을 통해서 작용함을 확인하였다. 또한 TDO 돌연변이형 DLX3는 이에 더하여 또 다른 전사인자인 CREB과도 결합하여 CREB에 의한 PPAR 전사 촉진효과를 차단하였다. C/EBP와의 결합에는 DLX3의 homeobox 도메인이 관여하였고, CREB과의 결합에는 TDO 돌연변이형 DLX3에서 돌연변이로 인해 새로이 생성된 C 말단 도메인과 homeobox 도메인이 모두 필요한 것으로 확인되었다. 이러한 결과는 TDO 돌연변이로 인해 DLX3의 C 말단 단백질구조가 변형되어 야생형에서는 나타나지 않는 새로운 단백질과의 상호작용을 통해 지방세포 분화를 더 강력하게 억제함을 시사하였다. 본 논문의 후반부는 Dlx5의 지방세포 분화조절 기전을 관찰하였다. Dlx3와 유사하게 Dlx5를 과발현 시키면 사람 골수줄기세포와 3T3-L1 세포의 지방세포 분화가 현저히 저해되었다. 또한 3T3-L1 세포의 지방세포 분화 과정 중 Dlx5의 발현이 감소되었고, Dlx5 siRNA를 처리하여 Dlx5 발현을 억제하면 지방세포 분화가 촉진되었다. DLX5도 C/EBP, CREB과 결합하여 이 전사인자가 PPAR 프로모터에 결합하는 것을 억제하였으며, 3T3-L1 세포에 PPAR 발현벡터를 전이시켜 과발현을 유도하면 DLX5의 지방세포 분화억제 효과가 소실되었다. C/EBP와의 결합에는 DLX5의 homeobox 도메인이, CREB과의 결합에는 C 말단 도메인과 homeobox 도메인이 모두 필요한 것으로 확인되었다. 이상의 결과는 조골세포 분화에 관여하는 전사인자인 Dlx3와 Dlx5가 지방세포 분화를 저해함으로써 결과적으로 줄기세포에서 지방세포 대신 조골세포로의 분화를 촉진하는 조절자로서 작용할 수 있음을 시사하였다. 또한 야생형에 비해 TDO 돌연변이형 DLX3가 지방세포 분화를 더 강력하게 저해한다는 결과는 TDO 환자에서 골수 줄기세포가 지방세포 대신 조골세포로의 분화가 상대적으로 증가하여 골밀도 증가에 기여할 수 있음을 시사하는 결과로 생각된다.

Dlx3 and Dlx5 is a homeobox domain (HD) protein that is involved in osteoblast differentiation. Deletion of four base pairs in human DLX3 gene is causally related to tricho-dento-osseous (TDO) syndrome, a genetic disorder manifested by taurodontism, hair abnormalities and increased bone density. The molecular mechanisms for the increased bone mineral density in TDO patients have not been clearly elucidated. Osteoblasts and adipocytes are derived from common bone marrow mesenchymal progenitors, and there are reciprocal relationships in the differentiation of osteoblasts and adipocytes. Therefore, it is suggested that an inhibitor of adipogenic differentiation may shift the fate of bone marrow mesenchymal stem cells (BMSCs) toward osteoblast lineage, resulting in bone formation. The purpose of this study is to investigate the regulatory role of Dlx3 and Dlx5 on adipogenic differentiation and to examine whether there are any differences in adipogenesis regulation between wild type DLX3 (wtDLX3) and 4-bp deletion mutant DLX3 (TDO mtDLX3). In the first part of this thesis, I examined the regulatory role of Dlx3 in adipocyte differentiation and compared the effect of wtDLX3 and TDO mtDLX3 overexpression on adipocyte differentiation. Over-expression of wtDLX3 and mtDLX3 in human BMSCs or 3T3-L1 murine preadipocytes suppressed adipogenic differentiation. However, anti-adipogenic effect of TDO mtDLX3 is much stronger than that of wtDLX3. Adipogenic induction of 3T3-L1 cells suppressed Dlx3 expression whereas knock-down of Dlx3 enhanced adipogenic differentiation of 3T3-L1 cells. The expression of PPAR, a master transcription factor for adipogenesis, was suppressed by wtDLX3 and mtDLX3 whereas over-expression of PPAR rescued adipogenic differentiation of 3T3-L1 cells that over-express wtDLX3 or mtDLX3. Although there was no putative HD-binding element within 1 kb of the PPAR promoter sequence, C/EBPα-induced PPAR promoter activity was suppressed by both wtDLX3 and mtDLX3 and CREB-induced PPAR promoter activity was suppressed by mtDLX3. Co-immunoprecipitation assays demonstrated that mtDLX3 binds to CREB and C/EBPα whereas wtDLX3 binds only to C/EBPα. Furthermore, the chromatin immunoprecipitation and in vitro DNA binding assays demonstrated that mtDLX3 prevents both C/EBPα and CREB from binding the PPAR promoter whereas wtDLX3 inhibits the DNA binding of C/EBPα only. Binding of wtDLX3 or mtDLX3 to C/EBPα required only HD whereas that of CREB to mtDLX3 required both HD and frame-shifted C-terminal domain. In the second part, I examined the regulatory role of Dlx5 on adipogenic differentiation. Over-expression of Dlx5 inhibited adipogenic differentiation of human BMSCs and 3T3-L1 cell line. Adipogenic induction of 3T3-L1 cells suppressed Dlx5 expression whereas knock-down of Dlx5 enhanced adipogenic differentiation of 3T3-L1 cells. Similarly to the Dlx3, Dlx5 down-regulated the expression of PPAR through the protein-protein interactions with CREB and C/EBP HD is required for interaction of Dlx5 with C/EBP whereas both HD and C-terminal domain of Dlx5 is necessary for binding of Dlx5 and CREB. These results indicate that Dlx3 and Dlx5 is a negative regulator for adipocyte differentiation, suggesting that these proteins may play an important role in fate determination of BMSCs to osteoblast lineage through the stimulation of osteogenic gene expression and the inhibition of adipogenesis. Furthermore, it is demonstrated that a frameshift by 4-bp deletion provides enhanced anti-adipogenic activity to mtDLX3, suggesting that enhanced anti-adipogenic activity of mtDLX3 may play some roles in increased bone density phenotype of TDO syndrome.