Screening for Interaction Partners of DEMETER in Arabidopsis thaliana

Abstract

DNA methylation and demethylation plays significant roles in regulating gene expression on variable stress reactions and TEs silencing. A DEMETER (DME), an active DNA demethylase in plants, is expressed in the central cell of the female gametophyte in Arabidopsis required for seed development and has glycosylase activity that can actively remove 5-mC that is replaced by cytosine via base excision pathway. DME induces maternal allele expression of the imprinted MEDEA (MEA) polycomb gene and the DNA glycosylase activity of DME leads to the DNA demethylation on its targets. In plants, there is no massive methylation reprogramming in embryo like mammal but instead, the companion cells whose DNA contents are not inherited to the next generation go through global demethylation and the hypomethylated state is maintained in late endosperm stage in which DME is no longer expressed.

Despite all these distinct significances, little is known about the interactors that associate with DME. Here, to identify the interacting partners of DME, I used Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC). From 83 genes that have been confirmed by the Yeast Two-Hybrid system that interact with DME, I primarily chose 18 candidates to test interaction. While examining these 18 candidates by BiFC, AT5G37930, AT5G60980, AT1G70620, AT5G23090 and the C terminal part of AT1G20960 showed fluorescent signals when it was co-transfected with DME in Arabidopsis Col-0 protoplasts. These interactors contain either E3-ubiquitin ligase activity, RNA binding motif, homologous feature of transcription factor which is related to histone acetylation, or are related to RNA splicing.

To further understand its relation with DME in plants one candidate, At1g20960 that is related to RNA splicing, was chosen and its mutant was crossed with dme mutant for phenotyping analyses. dme mutant allele transmission, segregation and seed abortion ratio shown in dme single mutant were not changed in double mutants. Therefore, by doing further experiments, using different candidates, this study would give some specific and clear perspectives and contribute to widen the knowledge by identifying a novel protein involved in the DME demethylation pathway in plants.

DNA의 메틸화와 디메틸화는 유전자의 발현을 조절하여 생물체가 직면하는 변화하는 주변 환경과 다양한 스트레스 상황에 대한 적절한 반응을 가능하게 하며 전이 인자의 발현을 억제하는 등의 역할을 하므로 매우 중요하다. DEMETER(DME)는 식물에서 작용하는 DNA 글리코실화 효소로 애기장대 암배우체의 중심세포에서 발현하며 종자의 발달에 필수적이다. DME는 염기절제회복방식을 통해 5-mC를 직접 제거하고 시토신으로 치환하는 방식의 디메틸화를 매개한다. 식물의 배에서는 포유동물과 같은 대규모의 메틸레이션 리프로그래밍이 일어나지 않는 대신 다음 세대로 유전 정보가 전달되지 않는 생식세포나 배의 주변 세포에서 전반적인 디메틸레이션이 일어나고 이러한 하이포메틸레이션 상태가 DME가 더 이상 발현하지 않는 후기 배주까지 유지된다.

이러한 중요성에도 불구하고 DME의 디메틸레이션 과정에서 DME와 상호작용하는 인자들에 대한 연구는 많이 알려진 바가 없다. 본 연구에서는 DME와 상호작용하는 인자들을 밝히기 위하여 이분자형광상보기법(Bimolecular Fluorescence Complementation)을 이용하였다. 효모이중잡종화(Yeast Two-Hybrid)를 이용한 선행연구를 통해 밝혀진 DME와 상호작용하는 83개의 유전자 중 18개의 후보 유전자를 우선적으로 선정하였고 그 중 AT5G37930, AT5G60980, AT1G70620, AT5G23090, 그리고 AT1G20960의 C 말단부가 애기장대 야생종(Col-0)의 원형질체에 DME와 함께 트랜스펙션되었을 때 형광 신호를 보이는 것을 확인할 수 있었다. 이 유전자들은 E3 유비퀴틴 라이게이즈 활성을 가지거나 RNA 결합 모티브를 가지며 히스톤 아세틸레이션과 관계된 전사인자의 상동 유전자를 포함한다.

추가적으로 이분자형광상보기법을 통해 밝혀진 유전자들과 DME의 관계에 대한 이해를 위해 RNA 스플라이싱에 관여하는 Brr2a를 암호화하는 유전자인 At1g20960을 이용하여 돌연변이 연구를 진행하였다. At1g20960의 T-DNA 삽입 돌연변이체인 emb1507-1 식물체를 ¬dme-2 돌연변이체와 교배하여 얻은 이중이형접합 돌연변이를 이용하여 종자의 발달단계 및 종자유산 여부와 돌연변이 대립유전자의 분리비, 트랜스미션의 변화를 중심으로 표현형을 분석한 결과 dme-2 단일 이형접합돌연변이체와 비교했을 때 해당 표현형들에서의 주목할만한 변화를 관찰할 수는 없었다. 때문에 식물에서 DME의 디메틸레이션 과정에 관여하는 새로운 인자를 밝혀냄으로써 이에 대한 구체적인 이해를 더하기 위해서는 추가적인 실험을 통해 분자생물학적 관점에서의 표현형 분석이 필요하며 At1g20960 외에 나머지 후보 유전자들에 대한 연구 역시 필요하다.